【摘 要】
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生物酶催化因其高特异性、环境友好性等优势,被认为是生命健康、资源、环境等领域的绿色催化方法。固定化酶可解决游离酶稳定性差、难回收等问题。传统的物理化学固定化技术存在工艺复杂、酶与载体兼容性差等制约因素,胞内酶全细胞催化技术存在底物与产物的传质限制等缺点,传统表面展示全细胞催化技术存在酶展示量低等问题。以解决上述问题为导向的新型高效固定化酶技术的研发成为生物催化领域的热点之一。受大肠杆菌（Esche
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生物酶催化因其高特异性、环境友好性等优势,被认为是生命健康、资源、环境等领域的绿色催化方法。固定化酶可解决游离酶稳定性差、难回收等问题。传统的物理化学固定化技术存在工艺复杂、酶与载体兼容性差等制约因素,胞内酶全细胞催化技术存在底物与产物的传质限制等缺点,传统表面展示全细胞催化技术存在酶展示量低等问题。以解决上述问题为导向的新型高效固定化酶技术的研发成为生物催化领域的热点之一。受大肠杆菌（Escherichia coli）生物被膜的重要组成成分淀粉样蛋白纤维curli的启发,本研究开发了一种基于大肠杆菌curli纤维系统的脂肪酶新型固定化技术。以具有广泛应用价值的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶（Thermomyces lanuginosus lipase,TLL）作为模式酶,基于三种功能模块（Csg A、SpyTag/SpyCatcher与Mrcp19k）,制备并表征了三种含有curli纤维的固定化TLL。利用Csg A的分泌与细胞表面自组装成高比表面积纤维的特性,借助SpyTag/SpyCatcher自发形成异肽键,突破大分子脂肪酶的分泌组装限制,辅以粘附蛋白Mrcp19k丰富非共价相互作用力形成的交联网状结构,进一步提高催化被膜的比表面积,以期获得酶负载量、酶活力与稳定性提高的新型固定化脂肪酶。主要研究内容及结果如下。（1）Ⅰ型curli固定化脂肪酶制备及表征。敲除大肠杆菌E.coli BL21（DE3）的csg A基因,获得csg A基因缺失型菌株BL21::ΔCsg A。以BL21::ΔCsg A为宿主,构建过表达Csg A-TLL融合蛋白与Csg A的基因工程菌。工程菌经诱导表达后,对其curli纤维进行表征。csg A基因回补结果表明,csg A基因赋予了大肠杆菌curli纤维分泌与自组装的能力。含有大分子脂肪酶的融合蛋白Csg A-TLL在一定程度上弱化了curli的分泌,从而影响了基于Csg A与TLL直接融合的I型固定化脂肪酶的酶负载量,获得的I型curli固定化TLL的酶活力为27 U/g湿细胞,循环反应5批次,酶活力几乎无损失。（2）Ⅱ型curli固定化脂肪酶制备与表征。引入能自发形成异肽键的SpyTag/SpyCatcher模块,构建基于Csg A-SpyTag/SpyCatcher的II型固定化脂肪酶。构建TLL及TLL-SpyCatcher（TLL-SC）表达工程菌,经表达纯化后,制备的纯化酶TLL和TLL-SC比酶活力分别为4764 U/μmol和4302 U/μmol。构建过表达Csg A-SpyTag（Csg A-ST）的工程菌BL21::ΔCsg A-Csg A-ST,待工程curli纤维生成,取0.1 g工程菌细胞与过量纯化酶液孵育制备II型固定化TLL,获得的II型固定化TLL的酶负载量为0.2μmol/g湿细胞,酶活回收率为88.7%,酶活力为811 U/g湿细胞。II型固定化TLL比游离TLL、TLL-SC具有更好的热稳定性、p H稳定性、有机溶剂耐受性及储存稳定性,循环反应5批次,酶活力仍能保持90%以上。（3）Ⅲ型curli固定化脂肪酶制备与表征。进一步引入粘附蛋白Mrcp19k,构建基于Csg A-SpyTag/SpyCatcher-Mrcp19k的III型固定化酶。构建过表达融合蛋白TLL-Mrcp19k-SpyCatcher（TLL-Mrcp19k-SC）的工程菌,经表达纯化后制备纯化酶TLL-Mrcp19k-SC,比酶活力为4723 U/μmol。过量纯化酶液与0.1 g工程菌BL21::ΔCsg A-Csg A-ST孵育制备III型固定化TLL,获得的III型固定化TLL的酶负载量为0.3μmol/g湿细胞,酶活回收率为113%,酶活力为1569 U/g湿细胞,循环反应5批次,酶活力仍能保持88%以上。与II型固定化TLL相比,III型固定化TLL在一定程度上提高了酶活力、酶活回收率和酶活稳定性。此固定化策略具有遗传可编程性,为其他酶的新型高效固定化技术开发提供新的思路与技术参考。构建的具有高活性与稳定性的固定化脂肪酶可尝试多种生物催化应用场景。
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