何首乌为蓼属植物何首乌(Polygonum multiflorum Thunb.)的干燥块根,具有多种药理作用。近年来报道,何首乌具有显著的降血脂和抗动脉粥样硬化等作用。2, 3, 5, 4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(简称二苯乙烯苷,TSG)为中药何首乌的主要水溶性成分,许多文献资料表明TSG具有抗氧化和清除自由基的特性,近年的研究亦证明,TSG对一些慢性病,如衰老、老年性痴呆、高血脂及动脉粥样硬化等,具有预防和治疗的作用。本文通过比较TSG单体成分与含相同量TSG的何首乌总提物(有效部位)的降血脂作用,确定TSG为何首乌降血脂的药效物质基础,并较深入地研究了TSG在动物体内的吸收、分布、代谢、排泄等一系列过程,为TSG的开发利用奠定了坚实的基础。七宝美髯丹是以何首乌为君药的复方制剂,含有多种有效成分,为了更好的控制药品质量,本文建立了RP-HPLC法同时测定二苯乙烯苷等七种组分的含量。第一部分何首乌降血脂作用的药效物质基础研究目的:比较研究何首乌有效部位(HSWAF)及有效成分TSG的降血脂作用,明确何首乌降血脂作用的药效物质基础。方法:观察HSWAF和TSG对正常小鼠血脂及肝指数的影响;小鼠腹腔注射Triton致急性高脂血症模型,观察HSWAF和TSG对模型动物血脂、谷草转氨酶(GOT)和谷丙转氨酶(GPT)水平的影响;以大鼠食饵性高脂血症为模型,给予高脂饲料的同时给予HSWAF和TSG,连续28天,测定血脂、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性,肝组织中总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量以及肝指数。结果:对正常小鼠,TSG和HSWAF均有升高血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C),降低血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的作用。HSWAF和TSG对腹腔注射Triton致高脂血症小鼠的血清TC和TG均有降低作用,对HDL-C均有升高作用。HSWAF 60 mg/kg明显降低大鼠食饵性高脂血症模型的肝指数;HSWAF 30 mg/kg和60 mg/kg明显降低大鼠食饵性高脂血症模型的血清TC、TG、LDL-C、MDA含量、TC/HDL-C比值,明显升高血清HDL-C和NO含量以及SOD活性,TSG对以上各项指标的作用强度略低于HSWAF,但无显著性差异。结论:何首乌中有效部位及有效成分TSG均具有调血脂、抗氧化,保护血管内皮的功能,TSG为发挥药效作用的主要物质,提示可用于防治高脂血症。第二部分二苯乙烯苷在高血脂模型大鼠体内的药动学研究与组织分布目的:研究TSG在不同高血脂病理模型动物体内的药动学及组织分布情况。方法:1.分别取正常大鼠,食靡性高脂血症模型大鼠和Triton致高脂血症模型大鼠,按60 mg/kg的剂量灌胃给予TSG,于给药后不同时间经眼球后静脉丛取血,置肝素化试管中,以3 000 r/min离心10 min,分离血浆。以虎杖苷为内标,用3倍量甲醇沉淀蛋白,取一定量上清液,于50℃氮气流吹干,用少量甲醇溶解后,取上清液20μl注入液相色谱仪。C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-甲醇-0.1%冰醋酸(12∶10∶78),检测波长320 nm ,流速为1.0 ml/min。记录TSG与虎杖苷的峰面积,计算TSG的血药浓度。2.分别取正常大鼠,食靡性高脂血症模型大鼠和Triton致高脂血症模型大鼠,按60 mg/kg的剂量灌胃给予TSG,分别于给药后5、15、45 min断头处死,分别取出心,肝,脾,肺,肾,脑,胃,小肠等组织,用生理盐水制成1∶2的组织匀浆。组织匀浆加3倍量甲醇沉淀蛋白,离心,取20μl上清液注入液相色谱仪。C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-甲醇-0.1%冰醋酸(15∶18∶67);检测波长320 nm ,流速为1.0 ml/min。测定组织中TSG的含量。结果:1.血浆中TSG在0.13~81.00μg/ml浓度范围内线性关系良好,高、中、低3种不同浓度血浆样品的方法回收率分别为99.7 %、98.9 %、98.3 %,日内与日间精密度RSD均<3.0 %。与正常大鼠相比,TSG在triton致高脂血症模型大鼠体内的Tmax有降低趋势,t1/2非常显著性缩短(p<0.01),Cmax、Ke、AUC0-t与AUC0-∞均非常显著性增加(p<0.01);脂肪乳致高脂血症模型大鼠与正常大鼠相比,AUC0-t与AUC0-∞显著性增加(p<0.05)外,其它参数均无显著性差异(p>0.05)。Triton致高脂血症模型大鼠与食靡性高脂血症模型大鼠相对正常大鼠的相对生物利用度分别为188 %和155 %。2.各组织中TSG浓度在0.65~162.00μg/ml范围内线性关系良好,高、中、低3种不同浓度肝脏匀浆样品的方法平均回收率分别为100.5 %、102.3 %、100.9 %,日内与日间精密度RSD均<3.0 %。与正常大鼠相比,在triton高脂血症模型大鼠体内,TSG除在肾脏中的分布有所减少外,其它均无明显变化;在食靡性高脂血症模型大鼠的心脏中明显减少,而在肝脏、脾脏和肾脏中均明显增加。结论:TSG在高脂血症模型动物体内的药动学及组织分布发生了某些变化,提示在进行药物的体内过程研究时应充分考虑机体的生理状态,在可能的情况下尽量选择相关的病理模型进行研究,使实验结果更接近真实情况。第三部分二苯乙烯苷的血浆蛋白结合率测定目的:研究TSG的血浆蛋白结合情况,并探讨用浊点萃取法(CPE)测定TSG血浆蛋白结合率的方法。方法:分别采用平衡透析法、超滤法和CPE法测定浓度为0.05、0.25、1.25 mg/ml的TSG与人血浆,牛血清白蛋白(BSA)和α1-酸性脂蛋白(α1-AGP)的结合情况,并将3种方法的测定结果进行比较。浊点萃取方法为:200μl样品,精密加入1.0 ml浓度为5 % (w/v)的Triton X-114溶液,涡旋混合,置35℃恒温振荡器中保温10 min,进行相分离,于3 000 r/min离心5 min,上层为水层(游离型药物),体积为850μl,下层为表面活性剂层(结合型药物),体积为350μl,用标准曲线法测定结合型药物的含量。结果:在不同浓度(0.05、0.25、1.25 mg/ml)下,用平衡透析法、超滤法和CPE法测得的TSG与血浆蛋白的结合率(%)非常相似,分别为:55.8±4.1、53.4±4.4、51.9±5.0,79.6±3.3、74.2±3.3、72.5±2.6,89.8±1.8、85.0±3.6、87.4±1.3。用平衡透析法和超滤法测得的结果均表明,TSG与血清白蛋白的结合率基本不随浓度发生变化(约60 %),与α1-AGP的结合率则随药物浓度的增加而明显降低,而用CPE法测定的两种蛋白的结合率均在80 %~90 %,与上述两种方法的差别很大。结论:CPE法可用于测定TSG的血浆蛋白结合率。TSG既能与血清白蛋白结合又能与α1-AGP结合,血浆中还可能存在其他能和TSG结合的蛋白质。第四部分二苯乙烯苷在大鼠体内的吸收动力学研究目的:建立同时测定胃灌注液及肠循环液中TSG及酚红浓度的HPLC/PDA法,并研究TSG在大鼠胃、肠的吸收特性。方法:采用大鼠在体胃、肠吸收模型,以HPLC/PDA法测定胃灌注液及肠循环液中药物的含量,色谱条件为:Dikma Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5μm);柱温30℃;流动相为乙腈-甲醇-0.2 %磷酸(35∶15∶50),流速1 ml/min;检测波长320 nm(TSG)和430 nm(酚红);进样量20μl。结果:TSG及酚红的线性关系良好,线性范围分别为3.5~140μg/ml和1~40μg/ml,日内、日间精密度(RSD)均小于3.1 %,方法回收率均在99.48 %~102.5 %之间。不同质量浓度(2.5、5、10 mg/ml)的TSG在大鼠胃部的每小时吸收百分率分别为72.7、67.7、56.6;不同质量浓度(30、60、120μg /ml)的TSG在肠道内的吸收速率常数分别为0.047 7、0.051 4、0.056 3,三者之间无显著性差异(P>0.05)。结论:本文首次建立了HPLC/PDA法同时测定胃灌注液及肠循环液中TSG及酚红的浓度,该法操作简便,结果准确,灵敏度高。研究结果表明,TSG在肠道内吸收较差,主要吸收部位是胃,为延长药物在胃内的停留时间,改善生物利用度,适合制成胃漂浮片。第五部分二苯乙烯苷在大鼠体内外的代谢研究目的:研究TSG在大鼠体内外的代谢产物和代谢途径。方法:采用肝微粒体温孵法,大肠杆菌培养法等对TSG进行体外代谢研究;灌胃给予一定量TSG后,对大鼠血液、胆汁、尿液、粪便、小肠内容物和胃内容物进行体内代谢产物的分析,通过制备液相获得主要代谢物的纯品,用1H-NMR、13C-NMR及MS手段进行结构确证,从而推测TSG在体内的转化过程。结果:在大肠杆菌培养液中,胃内容物中只有原型药物;尿液中既无原型也无代谢物;肠内容物中除原型外,还有少量代谢物M2;血浆中除原型外,还有代谢物M1(已经证明为TSG的葡糖醛酸结合物);胆汁中除可检测到原型药物外,还有大量的代谢物M2和少量的代谢物M1;粪便中检测到的主要是原型药物;在肝微粒体酶的作用下,TSG很快代谢为M2。结构鉴定证明,M2与M1结合部位不同,为TSGC3-OH的葡糖醛酸结合物。结论:TSG在肝脏代谢为葡糖醛酸结合物,并经胆汁排泄,在肠道内菌或酶的作用下水解为原型随粪便排出体外。第六部分二苯乙烯苷在大鼠体内的排泄研究目的:建立大鼠胆汁中TSG及其代谢物浓度的HPLC测定方法,明确TSG的代谢途径。方法:胆汁样品或用重蒸水稀释后的胆汁样品200μl,加入10μl甲醇后直接离心测定TSG及其代谢物的浓度。Dikma Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5μm),柱温30℃;流动相为乙腈-0.1 %冰醋酸梯度洗脱(0~10 min,15∶85;15~23 min,25∶75;25~30 min,100∶0),流速1 ml/min;检测波长320 nm。测定大鼠灌胃给予60 mg/kg的TSG后胆汁中TSG及其代谢物的累积排泄率。结果:TSG及其代谢物在胆汁中的线性范围分别为12.0~0.8μg/ml和110~0.9μg/ml,日内和日间RSD均小于7.0 %,准确度在±4.33 %之间。提取回收率均大于99.14 %。大鼠灌胃给予60 mg/kg的TSG后24 h内胆汁中TSG及其代谢物的累积排泄率分别为(0.084±0.04) %和(36.87±12.94) %。结论:经方法学考察符合生物样品的测定要求,可应用于大鼠胆汁中TSG及其代谢物浓度的测定,TSG在大鼠体内主要以代谢物的形式由胆汁排泄。第七部分二苯乙烯苷体内过程研究模式的建立及其应用目的:建立一种简便,快速的研究药物体内吸收、分布、代谢及排泄等全过程的方法模式,并应用于TSG的体内过程研究。方法:麻醉后的大鼠,进行胆管插管,采取原位胃吸收试验方法给予0.5 ml预热到37℃的含15 mg TSG的人工胃液,收集给药后20 min内的胆汁,取20 min后的胃内容物、胃粘膜、门静脉血、腹动脉血及尿液,采用酶解后的HPLC法分别测定各样品中游离TSG,TSG硫酸结合物,TSG葡糖醛酸结合物及TSG葡糖醛酸-硫酸结合物的含量。结果:给药20 min后有(64±9.8) %的TSG被胃部吸收,其中(4±2) %分布在胃粘膜内,(1.1±0.5) %经胆汁排泄,1 %左右存在于血液循环中。与门静脉血相比,在动脉血中游离TSG比例减少,结合型比例增加。胆汁中主要为TSG葡糖醛酸结合物。结论:TSG在胃部以游离形式被胃粘膜吸收,经肝门静脉进入肝脏,在肝脏内发生代谢作用,主要是与体内的葡萄糖醛酸和硫酸等内源性物质结合,最终经胆汁排出体外。第八部分七宝美髯丹制剂中二苯乙烯苷等七种组分的同时测定目的:采用HPLC/PDA法同时测定七宝美髯丹中二苯乙烯苷等七种组分的含量,以控制该制剂的质量。方法:Dikma Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5μm);流动相为乙腈和0.1 %冰醋酸进行梯度洗脱;检测波长:245 nm、320 nm、290 nm、350 nm;柱温30℃;流速1.0 ml/min。样品的提取方法为无水乙醇水浴回流2 h。结果:芦丁、二苯乙烯苷、阿魏酸、补骨脂素、异补骨脂素、大黄素、大黄素甲醚七种组分的线性关系均良好(r>0.999),线性范围分别为:0.0215~0.536、0.0450~1.125、0.0052~0.131、0.0113~0.283、0.0137~0.342、0.0046~0.116、0.0018~0.044 mg/ml,平均回收率分别为:102.1 %、101.4 %、100.4 %、100.9 %、100.0 %、100.2 %、99.99 %,精密度和重复性均良好。不同厂家生产的七宝美髯丹质量有很大差别。结论:该方法准确、快速、稳定,可用于七宝美髯丹的质量控制。