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昆虫围食膜是由中肠细胞分泌形成的一种半透性膜状结构,具有保护中肠上皮细胞和利于食物消化吸收的功能。作为昆虫体内的一道物理屏障,昆虫的围食膜能有效地阻止病原物入侵,因而破坏围食膜即能促进病原物对昆虫的侵染。利用微生物杀虫剂防治害虫具有不污染环境,对靶标害虫专化性强,且不易诱发抗药性等诸多优点,越来越受到人们的普遍重视。但同时存在杀虫速度慢、效果不稳定等缺点,严重影响了微生物杀虫剂的开发利用。因此研究昆虫围食膜的结构和蛋白组成以及破坏围食膜的分子机制,将会提高生物杀虫剂的杀虫效果,对促进生物防治在农业生产和医药卫生领域中的应用具有指导意义。
本研究采用形态学观察和SDS-PAGE方法,对健康粘虫和棉铃虫的正常围食膜以及不同的昆虫病原物粘虫核型多角体病毒(MsNPV)、苏云金杆菌(Bt)菌株HD-1晶体和荧光增白剂FB28处理后的围食膜结构和蛋白组成等进行分析,在此基础上,测定了荧光增白剂FB28对MsNPV和Bt菌株HD-1毒力的影响。具体结果如下:
1.棉铃虫和粘虫的围食膜均为一层无色透明厚薄均匀的长管状薄膜,表面光滑致密,没有小孔和缝隙,富有弹性和韧性。
首次分析了健康粘虫围食膜蛋白的组成,经SDS-PAGE分析后总共可分辨出九条带,分子量范围在28.3kDa到180kDa之间,其中有130kDa和72.3kDa两条主带;棉铃虫的围食膜总共可分辨出大约十六条带,分子量范围在26kDa到240kDa之间。其中五条主带,分子量分别为128.8kDa,47kDa,42.9kDa,29.1kDa和27.2kDa,其中以47kDa,42.9kDa两条带最亮,可能为其主要的结构蛋白。
2.首次研究了苏云金杆菌晶体蛋白、粘虫核型多角体病毒和荧光增白剂对围食膜结构和蛋白组分的影响:
(1)HD-1晶体对粘虫和棉铃虫围食膜结构和蛋白组分的影响分别开始于幼虫取食后2.5h和6h,在24h时这种破坏作用均得不到恢复。以4.7×106晶体/虫的剂量喂食粘虫2.5h时,其140kDa的蛋白带消失,而以HD-1晶体离体处理时对粘虫围食膜蛋白无影响;同样用HD-1晶体喂食棉铃虫6~24h时,38.8kDa和27.2kDa的带消失。由此可见,BtHD-1晶体对围食膜结构的破坏是长久的,也是较难恢复的。
(2)以1.38×107OBs/虫剂量的MsNPV喂食粘虫直至8h时,围食膜易碎成片状;24h时,围食膜又基本可以恢复完整,仅其靠近后肠的端部仍易碎成块状。SDS-PAGE分析表明,以1.38×107OBs/虫剂量的MsNPV饲喂粘虫30min时,51.8kDa的带几乎消失,2.5h时已完全消失,8h后开始恢复。而在离体条件下,MsNPV在处理30min时也可以造成51.8kDa蛋白的破坏。推测在MsNPV的多角体中可能含有破坏围食膜蛋白的成分。以等量的MsNPV饲喂非同源寄主昆虫棉铃虫8h时,发现29.1kDa的条带完全消失。尽管MsNPV对非同源寄主昆虫棉铃虫的围食膜蛋白组分发生作用的起始时间迟于对同源寄主昆虫粘虫的,但仍然具有破坏作用。
(3)用FB28(0.05mg/虫)喂食粘虫1h时,围食膜结构基本完整,但较易断裂成段,6h时,围食膜完全崩解,与食物混在一起呈絮状;至12h时又重新恢复正常。用0.05mg/虫的FB28喂食粘虫30min时,围食膜蛋白54.2kDa的条带消失,6h时又有小于54.2kDa的4条带消失,至12h时又可以恢复;当用同样的方法处理棉铃虫围食膜时,63.8kDa的条带消失,其变化规律与粘虫围食膜的54.2kDa条带相似。可见,FB28对粘虫和棉铃虫围食膜结构和蛋白的破坏作用具有普遍性,只是这种破坏作用是暂时的,当幼虫转而取食新鲜饲料时围食膜可以恢复正常。
3.生物测定结果表明,FB28对粘虫幼虫生长发育有一定的影响,可以延迟幼虫生长,但并不造成大量死亡。然而,FB28对粘虫幼虫生长发育的延迟作用是暂时的,这依赖于是否有FB28的持续存在。
本试验首次发现高浓度的FB28对BtHD-1(芽孢和晶体总数为2.8×105个/虫)不具有明显的增效作用,随着FB28浓度的升高,HD-1对粘虫的毒力逐渐降低。当混以0.001g/mL和0.01g/mL的FB28时,HD-1对粘虫幼虫60h的死亡率分别为93.35%和83.35%,与单独HD-1处理时的死亡率81.67%,相比虽有增加,但差异不显著;当FB28的浓度增加至0.1g/mL时,死亡率则下降为51.65%,反而对Bt的毒力有明显的抑制作用。
FB28对MsNPV(6.8×106OBs/虫)的增效作用是随着FB28浓度的增大而增加。单独用MsNPV处理80h时,幼虫的的死亡率为23.33%;当FB28的浓度为0.001g/mL时,即表现对MsNPV感染粘虫有一定的增效作用,幼虫的死亡率为33.33%;当FB28的浓度为0.01g/mL时,其死亡率为88.33%,比单独使用MsNPV时提高了283%;当FB28的浓度为0.1g/mL时,幼虫的死亡率为95.00%,较单独使用MsNPV时提高了300%以上。