论文部分内容阅读
卵巢癌为死亡率居首位的女性生殖器恶性肿瘤,耐药性的产生直接影响卵巢癌化疗效果及患者生存率,因此克服卵巢癌细胞耐药是卵巢癌治疗亟需解决的问题。纳秒脉冲电场(nanosecond pulsed electric fields, nsPEFs)因其特有的细胞内处理效应及非热损伤特点,受到国内外生物工程领域和医学领域研究者们极大关注,研究表明利用纳秒脉冲电场治疗肿瘤具有潜在优势。研究表明在特定脉冲参数纳秒脉冲电场作用后,线粒体介导了某些肿瘤细胞凋亡。本课题组前期实验提示,纳秒脉冲电场有可能诱导COC1和COC1/DDP细胞线粒体途径凋亡。本实验选择体外培养的人卵巢癌顺铂敏感细胞株COCl及耐药细胞株COC1/DDP为研究对象,试图利用纳秒脉冲电场跨细胞膜传递而直接作用于细胞核、线粒体等亚细胞单位的特性,以期为纳秒级脉冲电场对耐药肿瘤的治疗提供初步依据。目的：探讨纳秒脉冲电场对体外培养的人卵巢癌顺铂敏感细胞COC1及顺铂耐药细胞COC1/DDP的生长抑制、凋亡诱导效应及可能机制。方法：COC1和COC1/DDP细胞处理组以脉宽32 ns、场强10 kV/cm的纳秒脉冲电场处理10 min,对照组细胞未经nsPEF处理。WST-8法分析nsPEF处理后0.5 h、6 h、12 h和24 h, COC1及COC1/DDP实验组及对照组细胞存活率；为研究nsPEFs处理后12 h凋亡诱导效应及可能机制,应用Annexin V-FITC/PI双染结合流式细胞仪检测细胞凋亡率,同时用Hochest33342荧光染色观察细胞核变化；JC-1荧光染色定量及定性分析线粒体膜电位变化；化学发光法检测caspase-3蛋白酶活性；PI染色结合流式细胞术检测细胞周期。结果：1.纳秒脉冲电场处理后0.5 h、6 h、12 h和24 h,与对照组相比,COC1处理组细胞存活率降低(p=-0.001；p=-0.001；P=0.001； P=0.013),COC 1/DDP处理组细胞存活率也降低(P<0.001；P=0.001；P<0.001；P<0.001),两种细胞在纳秒脉冲作用后12h细胞存活率最低。纳秒脉冲作用后各时间点,与COC 1细胞相比,COC 1/DDP细胞存活率较高(p=-0.001；P<0.001；P<0.001；p=-0.026).2.纳秒脉冲电场处理后12 h,与对照组相比,COC1处理组细胞早期及晚期凋亡率均高(p=-0.001；p=-0.001),COC1/DDP处理组细胞早期及晚期凋亡率也增加(P=-0.005；P=-0.016),与COC1处理组相比,COC 1/DDP处理组早期及晚期凋亡率均较低(P=-0.002；P=0.001)；Hochest33342染色两种细胞处理组均可以明显地看到凋亡小体和呈亮蓝色致密浓染的颗粒块状荧光。3.纳秒脉冲电场处理后12 h,JC-1荧光染色COC1/DDP处理组细胞出现较多橘黄色或弥散分布的绿色荧光,COC 1处理组细胞则大多呈弥散分布的绿色荧光；与对照组相比,COC1处理组及COC1/DDP处理组JC-1红／绿荧光比值均降低(P=-0.001；P=0.002)。4.纳秒脉冲电场处理后12 h,COC 1细胞处理组caspase-3活性为对照组1.26±0.04倍,COC 1/DDP细胞处理组caspase-3活性为对照组1.16±0.02倍,两者处理组caspase-3活性均比对照组增高(P=0.000；P=0.000)。5.纳秒脉冲电场处理后12 h,与对照组相比,COC1处理组处于G0/G1期细胞百分率减少(P=0.002),处于S期细胞百分率升高(P=0.007)。COC1/DDP细胞处于G0/G1期、S期及G2/M期细胞百分率对照组与处理组间均无明显差别(P>0.05)。结论：纳秒脉冲电场抑制COC1及COC1/DDP细胞增殖,诱导细胞凋亡,阻滞COC 1细胞周期于S期。在诱导细胞凋亡过程中,线粒体的膜电位(mitochondrial transmembrane potential,ΔTm)下降,caspase-3蛋白酶活性增强,线粒体可能在纳秒脉冲电场诱导的细胞凋亡中起重要作用。