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研究背景:蠕虫在宿主体内迁移和发育过程中会通过持续释放分泌排泄产物（excretory-secretory product,ESP）来影响宿主的免疫微环境,降低甚至沉默宿主的免疫反应,从而实现免疫逃避。许多蠕虫ESP已被证明对宿主树突状细胞（dendritic cell,DC）的成熟有抑制作用,并且DNA甲基化/羟甲基化调控也被发现与DC的成熟有密切联系。然而,大片形吸虫能否借助其分泌排泄产物（FgESP）来影响宿主DC的成熟,这个过程是否受DNA甲基化/羟甲基化调控,尚不明确。本论文着重探讨FgESP是否能对自然宿主DC的成熟和功能产生基于DNA的甲基化/羟甲基化改变的影响,及其潜在的调节机制。研究方法:（1）建立和优化水牛外周血源DC的体外诱导和培养方法;（2）用不同浓度FgESP与水牛DC体外共孵育,qRT-PCR法检测DC表面分子MHC Ⅱ、CD83和细胞因子IL-6、IL-12基因转录水平的变化,组蛋白甲基化检测试剂盒测定FgESP作用后水牛DC的H3K4、H3K9、H3K27组蛋白甲基化水平的变化;（3）（h）MeDIP-Seq测序技术结合生物信息学分析FgESP对水牛DC全基因组DNA甲基化/羟甲基化水平的影响,并用q RTPCR法检测通过分析筛选出来的兴趣基因的转录水平;（4）基于Co-IP法检测FgESP中是否存在能与水牛DC的DNMT1/TET1蛋白直接结合的蛋白组分;（5）生物信息学软件预测水牛DNMT1和TET1蛋白的亚细胞定位;（6）细胞免疫荧光法观察与水牛DC共同孵育后FgESP在细胞中的定位;（7）通过RNAi技术人为下调水牛DC的DNMT1/TET1基因表达,q RTPCR法检测水牛DC表面分子CD1a、CD40、CD80、CD83、CD86、MHC Ⅱ mRNA表达量,ELISA法检测水牛DC细胞因子IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α的分泌水平。研究结果:本研究通过分离水牛外周血单个核细胞并进行体外诱导培养所获得的细胞,经形态学和表面分子标志鉴定,基本符合未成熟DC（im DC）特征。200μg/mL的FgESP体外作用48 h能诱导水牛DC MHC Ⅱ、CD 83和IL-12基因mRNA水平下调,IL-6 mRNA上调,表明FgESP对水牛DC的成熟存在抑制作用。组蛋白H3K4甲基化水平下调,H3K9甲基化水平上调,提示可能存在DNA水平上的甲基化/羟甲基化改变。（h）MeDIP-Seq测序结果显示,FgESP作用后水牛DC有5432个基因的5-甲基胞嘧啶（5-m C）水平和360个基因的5-羟甲基胞嘧啶（5-hm C）水平发生显著变化,其中有111个基因同时发生了5-m C和5-hm C水平改变。GO和KEGG分析表明这些基因高度富集于免疫应答相关通路中,部分涉及癌症相关通路。qRT-PCR验证高甲基化基因TLR2、TLR4和IL-12B的mRNA水平显著下调或呈下降趋势,高羟甲基化基因TNF-α的mRNA水平显著上调,提示FgESP对水牛DC成熟的抑制作用与DNA甲基化/羟甲基化存在直接联系。通过Co-IP法未检测到FgESP混合蛋白中能够与水牛DC的DNMT1/TET1结合的特异性蛋白组分,而细胞免疫荧光法观察到Cy3荧光标记的FgESP分布于DC细胞质中,因此与软件预测定位于细胞核的DNMT1和TET1蛋白不存在直接结合。相比正常水牛DC,RNAi人为下调DC的DNMT1/TET1基因表达后,FgESP体外诱导水牛DC分泌IL-6、IL-12的能力分别显著下降,提示FgESP对水牛DC成熟和功能的调控与DNMT1/TET1存在关联。结论:根据实验结果分析初步认为FgESP影响在体外培养的水牛DC成熟和细胞免疫应答的调控作用及其组蛋白甲基化水平。本研究首次报道了基于高通量测序技术获得的FgESP作用前后水牛DC全基因组DNA甲基化/羟甲基化谱;初步探讨了甲基化/羟甲基化相关分子DNMT1/TET1在参与FgESP与宿主DC互作过程中扮演的角色。研究表明:FgESP对水牛DC的成熟和免疫功能的发挥具有一定的抑制作用,该过程可能与TLR相关的信号通路有关;而DNMT1和TET1相关通路分别参与FgESP对DC分泌IL-6和IL-12能力的调控。这些研究结论将为进一步深入研究和阐释FgESP如何调控DC成熟和功能进而实现免疫逃避的具体机制提供重要的参考依据。