随着基因工程技术的发展,动植物品种特性的改良越来越多的需要靠转化多个基因来实现,于是杂交法、分次转化法、共转化法等多基因转化方法应运而生。但目前为止,所有这些方法都存在着费时、繁琐、转化效率低、需要不同的筛选标记基因等缺点。将多个基因串联在同一表达载体上进行一次性转化则显得非常有优势。然而,构建含有两个或多个基因表达盒的载体目前依然存在着许多困难。由于同尾酶酶切可获得相同的粘性末端,重组连接后,重组位点上原酶切位点消失,不能再被原同尾酶切开。本研究利用同尾酶这一特点,发明了一种简单易用的新方法,成功解决了多基因聚合技术这一难题,理论上可在同一载体上连接无限个基因表达盒。首先以pCR2.1-TOPO(invitrogen)为骨架,构建了一个上游带35S启动子,下游带Tnos终止子,两者之间为多克隆位点序列(MCS)的辅助载体pCR(-XbaI-35S-MCS-Tnos-SpeI-XbaI-)。目的基因1、2、3…分别亚克隆到该辅助载体的MCS上,相应带有目的基因的重组质粒分别命名为pCREC1、pCREC2、pCREC3…。这样每个基因表达盒两端都带有XbaI位点,并且在Tnos终止子与下游的XbaI酶切位点之间有一个SpeI酶切位点。由于XbaI和SpeI是同尾酶,二者酶切后可获得相同的粘性末端。所以XbaI酶切pCREC2得到基因表达盒EC2,可连接到pCREC1的SpeI位点上,得到带有两个基因表达盒的新质粒pCR(-XbaI-EC1-SpeI/XbaI -EC2 -SpeI-XbaI-)。又由于新连入的EC2 3?末端仍然带有一个SpeI酶切位点,从而可以再连接由XbaI从pCREC3质粒酶切而来的第三个基因表达盒EC3。利用这种方式,可以依次连入多个基因表达盒。最后用XbaI从该辅助载体上酶切下构建好的包含多个基因表达盒的DNA片段,连接到植物双元表达载体pCambia2300上,从而获得包含多个基因表达盒的植物表达载体。为了验证此方法的可行性,我们构建了含有报告基因GUS、GFP及筛选标记基因BAR的3基因表达载体pCambia3EC,同时我们还将此法应用到长链不饱和脂肪酸EPA/DHA(鱼油的主要有效成分)的植物反应器研究中,构建了包含EPA合成代谢途径中的4个关键基因的植物表达载体pCambia4EC,并初步进行了拟南芥转化验证。PCR及酶切鉴定证明构建的表达载体带有全部目的基因。我们分别把两个表达载体转化到根癌农杆菌GV3101中,并且进行了拟南芥遗传转化,26棵三基因和58棵四基因转基因拟南芥分别在除草剂和卡那霉素培养基上检测出,转基因情况正在鉴定之中。以上研究结果表明:此法不但理论上简单可靠,实践上也简单可行。通过设计,我们仅用两个同尾酶XbaI和SpeI就解决了多基因聚合载体的构建难题,为今后科学研究与基因工程改良植物的生产实践提供了一种简单、易用、灵活、可靠、低成本的多基因表达载体构建的新方法。