论文部分内容阅读
目的利用腹腔注射异丙肾上腺素(isoprenaline,ISO)在野生型C57BL/6(wild type,WT)和TLR4基因敲除(toll-like receptor 4 knockout,TLR4-/-)两种小鼠体内构建心肌缺血模型:(1)观察心肌缺血时,两种小鼠体内高迁移率蛋白B1(high mobility protein B1,HMGB1)以及Toll样受体4(TLR4)表达水平是否升高;(2)TLR4基因敲除是否对ISO诱导的心肌缺血有一定抑制作用;(3)探讨HMGB1-TLR4信号通路是否在心肌缺血损伤中起到重要作用,HMGB1是否通过TLR4途径影响心肌缺血所导致的的免疫炎症反应,为今后更深入研究提供更多的理论基础。方法8周龄大小的C57BL/6野生型小鼠和TLR4基因敲除小鼠腹腔注射异丙肾上腺素20mg/kg/只持续注射7天,构建心肌缺血模型,从病理水平、心功能以及整体状态证实造模成功,两种实验小鼠各分为5组:1、野生型C57BL/6小鼠:(1)空白对照组(WT-Control组);(2)生理盐水组(WT-Saline组):实验过程中每天腹腔注射生理盐水20mg/kg/天;(3)心肌缺血组(WT-ISO组):腹腔注射ISO20mg/kg/只,连续注射7天至造模成功;(4)重组HMGB1预处理组(WT-rHMGB1-ISO组):于造模前两天腹腔注射重组HMGB1 10μg/只连续注射2天;(5)HMGB1阻断组(WT-ISO-Anti-HMGB1组):于造模结束后腹腔注射抗HMGB1抗体400μg/只;2、TLR4基因敲除小鼠:(1)空白对照组(TLR4-/--Control组);(2)生理盐水组(TLR4-/--Saline组):实验中每天腹腔注射生理盐水20mg/kg/天;(3)心肌缺血组(TLR4-/--ISO组):腹腔注射ISO 20mg/kg/只,连续注射7天至造模成功;(4)重组HMGB1预处理组(TLR4-/--rHMGB1-ISO组):于造模前两天腹腔注射重组HMGB1 10μg/只连续注射2天;(5)HMGB1阻断组(TLR4-/--ISO-Anti-HMGB1组):于造模结束后腹腔注射抗HMGB1抗体400μg/只。用免疫蛋白印迹法(Western Blotting)方法检测心肌组织HMGB1、TLR4的蛋白水平,利用实时荧光定量逆转录技术(Real time PCR)方法检测心肌组织HMGB1、TLR4、TNF-α、IL-6的RNA表达水平。结果(1)心肌缺血时小鼠心肌组织中HMGB1的改变:Western Blot检测各组小鼠心肌组织中HMGB1蛋白表达水平,RT-PCR检测各组小鼠心肌组织中HMGB1的mRNA表达,免疫组化检测小鼠心肌组织中HMGB1的水平,在两种小鼠中与空白对照组相比,ISO组和rHMGB1组HMGB1蛋白水平和RNA水平均升高(P<0.05),Anti-HMGB1组HMGB1蛋白水平和RNA水平较ISO组降低(P<0.05),结果显示HMGB1在ISO诱导的心肌缺血损伤中起到重要作用;(2)心肌急性缺血时心肌组织中TLR4的变化:在野生型小鼠中,Western Blot检测各组小鼠心肌组织中TLR4蛋白表达水平,RT-PCR检测各组小鼠心肌组织中TLR4的mRNA表达,免疫组化检测小鼠心肌组织中TLR4的水平,与空白对照组相比,WT-ISO组TLR4的蛋白和RNA表达明显增高(P<0.01),同时相较于WT-ISO组,WT-rHMGB1组TLR4的蛋白和RNA表达有所增高,WT-ISO-Anti-HMGB1组TLR4水平下降(P<0.05),说明HMGB1可能部分通过与其受体TLR4结合进一步介导心肌缺血性损伤;(3)TLR4基因敲除对HMGB1-TLR4通路的影响:RT-PCR检测各组小鼠心肌组织中TNF-α和IL-6的mRNA表达,在野生型C57BL6小鼠中,与WT-Control相比,WT-ISO,WT-rHMGB1-ISO组IL-6及TNF-αRNA表达明显升高(P<0.01),WT-ISO-Anti-HMGB1组IL-6和TNF-αRNA表达明显低于WT-ISO组(P<0.05),在TLR4基因敲除小鼠中,造模后小鼠TNF-α和IL-6的水平并没有明显变化,说明TLR4基因敲除部分阻断由ISO诱导的小鼠心肌急性缺血损伤。结论心肌缺血时,HMGB1作为一种晚期炎症因子有明显升高,其机制可能主要为当心肌缺血时,HMGB1从细胞核内释放出来,与其受体TLR4结合,进一步促进下游通路的炎症因子的释放最终加重心肌损伤,起到促炎效应。