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目的:脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)可发生于多种眼底疾病,最终导致视功能严重且不可逆性丧失,但目前尚缺乏安全、有效的治疗方法。如何在封闭CNV的同时尽可能减少对周围正常组织的损伤是半导体激光治疗CNV的关键。热休克蛋白70(heat shock protein 70,Hsp70)是一种分子伴侣,在热刺激或其他应激条件下合成增多,对生物组织具有抗凋亡和抗坏死的双重保护作用。本实验首先检测体外培养的猴脉络膜视网膜血管内皮细胞(RF/6A)进行810 nm半导体激光照射后Hsp70的表达,之后观察高能量激光照射联合阈值下激光预照射对细胞的影响,最后通过视网膜下腔注射Matrigel建立非激光诱导的CNV动物模型,为进一步在活体内研究半导体激光阈值下预照射治疗CNV打下基础。
方法:细胞实验部分,首先应用不同功率的810 nm半导体激光对RF/6A细胞进行照射,光斑直径10 mm,曝光时间60秒,激光照射后在倒置光学显微镜下观察细胞形态,Annexin V-FITC和碘化丙啶(propidium iodide,PI)双染色流式法检测细胞活力及确定造成细胞损伤的激光能量阈值,并分别在激光照射后6,12,18,24和48 h采用western blot法检测细胞Hsp70的表达,应用免疫荧光法检测Hsp70在细胞中的分布;之后将RF/6A细胞分组,在进行高能量激光照射前给予或不给予阈值下激光预照射,照射后在光学显微镜下观察细胞形态,Annexin V-FITC和PI双染色流式法检测细胞活力,TUNEL法检测细胞凋亡,western blot法检测细胞Hsp70的表达及免疫荧光法检测细胞中活化caspase3的表达。动物实验部分,对健康成年棕色挪威(Brown Norway,BN)大鼠视网膜下腔注射Matrigel或磷酸盐缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)2μl,分别在注射后3天和1、2、3、4、5、6周进行眼底照相、眼底荧光血管造影(fundus fluorescein angiography,FFA)、吲哚菁绿血管造影(indocyanine green angiography,ICGA)和组织病理学检查。
结果:810 nm激光造成RF/6A细胞损伤的阈值功率为1100 mW(能量密度84.08 J/cm2),应用低于此能量的激光照射后,细胞中Hsp70表达明显升高,以600~1000 mW(能量密度45.86~76.43 J/cm2)最为显著。Hsp70在照射后12 h达到高峰并持续至18 h,24 h后逐渐降低,约48 h恢复到正常水平,免疫荧光染色显示激光照射后Hsp70在胞浆和胞核中均明显表达。RF/6A细胞在高能量激光照射前给予或不给予阈值下预照射其细胞存活率均显著下降,但前者在光学显微镜下大多呈凋亡形态,TUNEL检测可见大量TUNEL阳性细胞,免疫荧光检测可见活化caspase3表达;而后者细胞大多坏死,极少见TUNEL阳性细胞和活化caspase3表达;western blot检测显示前者细胞Hsp70的表达明显高于后者。BN大鼠视网膜下腔注射Matrigel后1周,病理检查见视网膜色素上皮(retinal pigmented epithelium,RPE)细胞离开Bruchs膜向光感受器层迁移;注射后2周,RPE下新生血管形成;注射后3周,FFA在远离注射点的Matrigel沉积区出现荧光素渗漏,ICGA晚期在相应部位可见高荧光;注射后4周,FFA渗漏持续存在,局部出现视网膜深层出血;注射后6周,视网膜出血吸收,FFA显示仍有渗漏,病理显示局部视网膜结构紊乱,并可见大量巨噬细胞浸润。
结论:810 nm半导体激光阈值下照射可以诱导体外培养的猴脉络膜视网膜血管内皮细胞Hsp70高表达。半导体激光阈值下预照射联合高能量激光照射可能通过Hsp70高表达使细胞发生凋亡而避免坏死。视网膜下腔注射Matrigel可以诱导BN大鼠CNV形成为今后在活体内探讨半导体激光治疗CNV打下基础。