一、目的:肝癌是第六大常见癌症和第四大癌症相关死亡的原因。由于起病隐匿,早期诊断困难,高度侵袭和生长迅速的特点,发现时已经失去手术指征,治疗效果极差,晚期肝癌患者5年生存率仅为18%,而有远处转移的肝癌患者5年生存率低至3%。尽管近年来有一些新的方法治疗肝癌,临床上治疗肝癌仍是手术切除和肝脏移植为主,最近的研究表明,这些治疗方法效果欠佳并且有诸多缺点,包括治疗后复发、化疗耐药性和肿瘤转移。肝切除术后没有辅助治疗通常被认为是肝癌术后复发的主要原因,单纯手术切除在提高肝癌临床治疗效果上达到了瓶颈阶段。因此,积极探索肝癌发生发展的机制,研发特异性的靶向药物,联合多学科综合治疗对于肝癌的治疗至关重要。Hippo信号通路是一种进化高度保守的信号通路,在动物体内通过调节细胞增殖和凋亡来调节体内平衡,该通路异常与多种人体肿瘤的发生发展密切相关,包括肺癌、卵巢癌、肝脏、前列腺癌和结直肠癌,而且Hippo信号通路异常的病人往往预后很差。越来越多的证据表明,Hippo信号通路对细胞干性维持、调节细胞代谢和上皮间充质转化的作用非常重要。对Hippo-YAP信号通路的研究热点之一就是其与肝癌的关系,目前许多研究都表明,肝癌细胞中存在Hippo-YAP信号通路的调节异常。其作为第一个被认定为调节器官大小的通路,已被确定为影响肝生长的主要因素。这一通路的任何异常都会使肝脏持续过度生长并最终导致肝细胞癌或胆管癌。YAP蛋白是Hippo通路下游的一个关键作用的效应分子,在促进细胞增殖、抑制细胞凋亡扮演着重要的角色,其异常活化将导致细胞失去接触抑制,促进细胞恶性转化。Hippo通路通过磷酸化YAP蛋白或直接结合的方式使YAP蛋白滞留于细胞浆中而无法发挥其作用。YAP蛋白主要与转录因子TEAD家族蛋白结合来调控Hippo信号通路下游基因。能抑制YAP-TEAD结合的小分子及肽段都能减弱因YAP活化而导致的细胞表型。YAP蛋白的表达增加及其活性增强与多种肝癌发展相关,如肝母细胞癌、肝细胞癌和胆管细胞癌。实验表明,YAP蛋白活化时肝癌发生早期的重要标志并影响肝癌的发展。脂代谢激活脂蛋白受体(The lipolysis stimulated receptor,LSR)是一种I型单次跨膜受体蛋白,主要分布在肝脏同时也在小肠和许多其他组织。LSR能通过改变血中游离脂肪酸的吸收调节餐后血浆甘油三酯水平。另外,LSR被确认为是一种上皮组织三细胞紧密连接(tricellular tight junctions,tTJs)的主要组成成分之一,起到细胞屏障、选择性调节小分子物质通过和维持细胞极性的作用,为上皮细胞紧密连接的特殊形式。并且LSR在特定的肿瘤细胞中表达,如膀胱癌细胞,可能表明其在肿瘤发生过程中起到作用。研究表明,在人类子宫内膜癌低表达LSR可以通过上调Hippo通路下游蛋白TEAD1/AREG促进肿瘤细胞侵袭和迁移,然而,LSR如何参加Hippo信号通路调控的具体机制仍不明确。YAP作为独立的肝细胞癌预后标记,也可能与LSR在肝癌的发展过程中起到协同作用。本文旨在揭示LSR与肝癌临床预后的影响,并初步阐明LSR抑制肝癌细胞增殖的作用及其机制,为肝癌的早期诊断提供新的思路及理论依据,并为肝癌的靶向治疗提供可能的治疗靶点。二、方法:1、通过收集大连医科大学附属第一医院肝胆外科手术切除新鲜肝癌标本及正常肝癌组织切缘3例。其中,所有标本均根据病理学组织鉴定为肝癌。针对各自标本查找相关病例资料并且获取患者的临床资料(性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径、切缘、组织学分级、淋巴结转移、病例分型),人体伦理研究协议由大连医科大学附属第一医院伦理委员会批准。2、Western blot及免疫组织化学法检测肝癌组织及正常肝脏组织中LSR内源性表达量。3、临床肝癌数据库分析内源性LSR表达量与患者生存时间的关系。临床数据分别来自GEO(Gene Expression Omnibus)数据库(记录号:GSE10043,GSE27150)和TCGA的数据库,采用PROGgeneV2进行收集,共454例。4、稳定敲低LSR细胞株构建:选取内源性高表达LSR细胞株Hep3B和Huh7肝癌细胞系培养;应用慢病毒感染细胞,得到稳定敲低LSR的单克隆细胞株,并进行蛋白表达检测,并应用于进一步实验步骤。5、LSR对肝癌细胞的生长抑制作用:使用上述稳定敲低内源性LSR蛋白的细胞株分别进行克隆形成试验、悬浮细胞成球试验、裸鼠皮下成瘤试验。6、通过Western blot检测敲低LSR后Hippo-YAP通路关键蛋白的影响。构建慢病毒过表达LSR质粒并包装慢病毒颗粒,感染内源性低表达LSR的肝癌细胞株SNU4449并检测过表达LSR后Hippo-YAP通路关键蛋白的影响。7、激光扫描共聚焦下检测稳定敲低LSR后细胞内源性YAP的定位变化。8、细胞核质分离试验检测敲低LSR后YAP蛋白在细胞中的分布情况。9、免疫共沉淀检测LSR蛋白与YAP蛋白的相互作用情况、其相互作用强度是否受Hippo通路上游蛋白影响。激光扫描共聚焦试验并检测LSR与YAP蛋白在细胞内共定位情况。10、通过分子克隆试验构建LSR突变体,并通过免疫沉淀、激光扫描共聚焦试验、Western blot试验检测LSR野生型与其突变体与YAP蛋白的相互作用情况、细胞内共定位以及对Hippo通路的影响。三、结果:第一部分LSR在肝癌组织中的表达及预后相关性研究1、LSR在肝癌组织中表达低于正常肝细胞通过Western blot对临床人肝癌组织及其配对的正常肝组织的对比,我们发现在肝癌组织中内源性LSR的蛋白表达量降低。而进一步通过免疫组化试验也证明了这一点。对此我们通过对临床肝癌数据库的分析,同时也发现,在肝癌中LSR的表达量与临床肝癌患者的肿瘤生存期密切相关。相对于低表达LSR,高表达LSR的患者危险度减少11%(高表达LSR组VS低表达LSR组:HR=0.89,95%CI:0.81-0.97,P=0.008)。表明LSR能抑制肝癌的发展及预后。为此我们将通过细胞水平对LSR蛋白对肝癌的作用进行深入研究。2、敲低内源性LSR后,肝癌肿瘤细胞增殖能力增强筛选不同肝癌细胞株内源LSR的表达量,选取内源性高表达肝癌细胞株Hep3B、Huh7进行稳定敲低LSR细胞株构建,挑取单克隆细胞株培养,通过Western blot检测敲低效率。构建成功后,首先进行体外增殖试验及克隆形成试验,结果表明,敲低内源性LSR后,肝癌细胞株相对于对照组,其克隆形成数量明显增多,其结果具有统计学意义(P<0.01)。同时,通过对4周龄雌性裸鼠进行皮下成瘤试验,结果表明敲低内源性LSR后,肝癌细胞株裸鼠皮下成瘤明显增大,生长更快,其结果具有统计学意义(P<0.01)。为进一步探究敲低LSR后对细胞株影响,试验采用低粘附培养皿对细胞株进行低粘附培养,以对比LSR对细胞株3D成球能力的影响,结果表明敲低内源性LSR后,肝癌细胞株低粘附培养板中,其细胞球更多,形态更大、颜色更加不透明。第二部分1、LSR通过抑制Hippo-YAP信号通路关键蛋白YAP蛋白的活性抑制肝癌细胞功能的研究对于稳定敲低LSR的肝癌细胞株,通过Western blot检测Hippo-YAP通路相关蛋白表达结果,结果显示:Hep3B、Huh7细胞稳定敲低LSR后,YAP蛋白磷酸化减少,下游CTGF、Cyr61蛋白表达上升。结果表明:敲低LSR可使Hippo通路核心蛋白YAP磷酸化降低,YAP蛋白入核增加,下游蛋白表达增加。与此对比,在内源性LSR低表达的SNU449细胞株构建LSR过表达细胞株后,Western blot检测Hippo通路相关蛋白,发现野生型LSR使p-YAP含量增加,突变型则使其恢复至对照组水平。我们通过对敲低细胞株进行激光共聚焦试验,发现应分布于细胞质中的YAP蛋白在敲低LSR后细胞核聚集增加。YAP的活化状态受其磷酸化影响,我们下一步将敲低细胞株进行细胞核质分离试验,发现敲低LSR后细胞浆中YAP蛋白表达减少,细胞核中YAP表达增加。相应在细胞浆中存在的p-YAP则在细胞浆中表达量相应减少。2、LSR通过其PPXY结构模体与YAP蛋白相互作用我们分析LSR分子结构后发现其存在与YAP结合经典的结构域PPXY(LSR分子中为PPPY),并且其同时存在能与Hippo信号通路下游调节蛋白14-3-3s蛋白相互作用的结构域。我们通过定点突变技术,将PPXY模体的关键氨基酸酪氨酸(tyrosine,Y)突变为丙氨酸(alanine,A)。通过免疫共沉淀技术,发现LSR-WT可以与YAP结合,而突变后的LSR-Y623A则与YAP无结合。免疫共聚焦试验也表明,LSR-WT与YAP在细胞中存在共定位,而LSR-Y623A则与YAP的共定位作用并不明显。3、通过在免疫共沉淀中加入Hippo通路上游激酶蛋白MST2及LATS2,发现LSR与YAP的相互作用减弱,而使用XMU-MP-1抑制其上游激酶活性,其对LSR-YAP的相互作用的减弱消失。进一步表明LSR与YAP的相互做用受到其上游激酶MST2及LATS2的调控。4、14-3-3s蛋白参与LSR抑制肿瘤过程中我们通过免疫共沉淀,比较LSR-Y623A、LSR-S493A与野生型的关系,发现想对于LSR-Y623A的,LSR-S493A与YAP的作用弱与野生型,但强于LSR-Y623A。进一步Western blot试验表明,LSR-S493A对Hippo通路蛋白的影响均弱于LSR-Y623A。于此同时,我们同时进行过表达LSR野生型及其突变体的激光共聚焦试验,发现其LSR-WT的能使YAP细胞核定位减少,LSR-S493A、LSR-Y623A则无明显此效应。表明14-3-3s蛋白参与到LSR抑制肝癌细胞过程之中。四、结论:1、LSR在人肝癌组织的表达降低。相对于低表达LSR,高表达LSR的患者危险度减少11%。2、敲低LSR高表达肝癌细胞后,能促进肝癌细胞增殖,其克隆形成能力、细胞成球能力、裸鼠成瘤能力均增强。3、LSR通过调节Hippo-YAP信号通路关键蛋白YAP蛋白的活性抑制肝癌细胞功能4、LSR通过其PPXY结构模体与YAP蛋白相互作用5、LSR与YAP的相互作用受YAP上游激酶活性及Verteporfin影响6、14-3-3s蛋白参与LSR抑制肿瘤过程中