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透明质酸(Hyaluronic Acid, HA),又名玻璃酸,是以p-D-N-Z,酰氨基葡萄糖(β-D-N-acetyl-glucosamine)和β-D-葡萄糖醛酸(P-D-glucuronic acid)为结构单元,由β-(1→3)糖苷键和β-(1→*4)糖苷键交替连接而成的一种聚阴离子糖胺聚糖,Mr为105～107Da。HA被广泛应用于食品、医学及化妆品等领域,是由于HA具有高度持水性、可塑性、渗透性、粘弹性和生物易吸收性。HA的相对分子量大小与使用效果和生物活性的关系密切,其中,Mr在(1-8)×104Da之间的低分子量透明质酸(LMWHA)和Mr<1×104Da的寡聚透明质酸(o-HA)属于小分子多糖,具有医学应用作用,能够抗肿瘤、促进血管生成、促进创伤愈合、有致炎与免疫调节等作用。其性质与普通HA有很大不同,甚至具有完全相反的作用,其所具有的生物活性引起了人们的广泛关注。透明质酸酶作为工具酶酶解生产LMWHA及o-HA具有降解条件温和,无污染,过程可控,得率高等优点。另外,透明质酸酶在医学领域也有重要的生物学作用。基于此,本论文从透明质酸酶高产菌筛选鉴定、系统发育树建立奠定后续工作的理论基础,并且对发酵生产透明质酸酶条件进行了优化。一、透明质酸酶产生菌株的筛选与鉴定利用平板快速筛选法,从空气中富集筛选得到一株透明质酸酶高产菌株,通过形态观察、生理生化特性研究和16S rDNA序列分析,鉴定该菌株属于芽孢杆菌属,为一新发现的产酶菌种,命名为Bacillus sp.TF18。菌株筛选过程中,使用平板透明圈观察法,使筛选结果更加直观准确,有效提高了筛选效率。同时酶活测定方法用紫外分光光度法代替浊度法(《中国药典2010年版》),大大缩减了酶活测定的工作量,提高了准确性,降低了由于操作、试剂、环境等因素所引入的误差,确立了适合于本研究的透明质酸酶活性快速测定方法。二、Bacillus sp. TF18发酵产酶条件的优化本文以实验室筛得芽孢杆菌TF18 (Bacillus sp.TF18)作为出发菌株,对其种子培养条件进行优化,最佳碳源是葡萄糖,最佳氮源是酵母粉和蛋白胨,摇瓶转速是150r/min,温度为36℃。应用单因素试验得出发酵培养基最佳配比为葡萄糖40g/l、酵母粉7g/L、蛋白胨9g/L, MgSO4 · 7H2O 2.5g/L. KH2PO42.2g/L。发酵温度为35℃,摇瓶装液量为100mL/500mL,透明质酸酶的产量为15U/mL。