在机体早期发育的过程中暴露于双酚A可导致机体发育关键器官和组织发生表观遗传特征的改变,并导致成年阶段的能量代谢稳态的破坏,产生胰岛素抵抗、糖耐量受损等2型糖尿病特征。如果FO代的母体在怀孕和哺乳阶段受到了双酚A的直接暴露,则其F1代的原始生殖细胞同样处于BPA的直接暴露之下,并由此导致F1代生殖细胞表观遗传信息的改变,这种改变可以通过生殖细胞再传递给F2代个体。双酚A可以通过改变原始生殖细胞的表观遗传信息,从而导致隔代的毒理效应,这种推理存在理论上的可能。因此,F0代母体在围产期暴露于双酚A是否会使得F2代个体与F1代一样,产生能量代谢紊乱的症状,是一个不可回避的问题。在本研究中,F0代SD大鼠在怀孕和哺乳期间通过灌胃的方式每天给予40μg/kg/day的BPA暴露,而随后的与F1代雄鼠交配的雌鼠和F2代大鼠均不再受到BPA的直接暴露。我们通过葡糖糖耐量实验(ipGTT)和胰岛素耐量(ipITT)实验,以及瘦素脂联素等血生化指标来反映F2代的葡萄糖稳态和胰岛素抵抗水平,并通过发现胰岛素通路关键基因的表达改变来进一步证实胰岛素抵抗和糖耐量损伤的状态。同时,我们继续在F2代的肝脏和F1代的生殖细胞中寻找可能的表观遗传靶点。我们的研究结果发现,相对于对照组双酚A暴露组的F2代大鼠,其葡萄糖耐量谁和胰岛素耐量水平均出现了明显下降,同时肝脏葡萄糖激酶(GCK)的基因相对表达水平也显著下调。甲基化测序结果显示,GCK启动子区域的12个甲基化位点在BPA暴露组的F2代肝脏组织为全部为甲基化的状态,而在对照组F2代大鼠中则有5个位点为非甲基化的状态。在F1的精子中,仅CpG位点-314中在BPA暴露组和对照组之间呈现不同的甲基化状态。而无论是F2代肝脏还是F1代雄性大鼠的精子,BPA暴露组均出现了明显地全基因组低甲基化现象。同时,BPA暴露所导致的F2代胰岛素抵抗和糖耐量异常,F2代肝脏Gck基因甲基化模式的改变,以及F1代精子Gck基因甲基化模式的改变,与F1代能量代谢紊乱症状和F1代神经行为发育异常之间没有显著地相关性。提示F2代所产生的现象时由F0代母鼠围产期暴露于BPA所直接导致的。本研究的结论是,FO代妊娠和哺乳期BPA暴露可引起F2代的胰岛素抵抗和糖耐量受损通,而DNA甲基化的改变是主要的作用机制。然而F1代的精子中所携带的BPA暴露导致隔代能量代谢紊乱的表观遗传信息靶点有待进一步地阐明。第一部分：F0代围产期BPA暴露对F2代糖耐量和胰岛素抵抗的影响目的：研究FO代母鼠怀孕和哺乳阶段BPA暴露对F2代糖耐量和胰岛素抵抗的影响。方法：将F0代孕鼠随机分为对照组和BPA暴露组,从受孕第0天开始分别进行玉米油和BPA (40μg/kg body weight/day)灌胃染毒。F1代雄鼠大鼠成年后与未受到过BPA暴露的成年雌性大鼠交配,以此产生F2代大鼠。F2代大鼠出生后,记录每窝产仔数,并持续测量其体重变化和摄食量的变化。F2代大鼠出生后的第9周和第20周,通过胰岛素耐量实验(ipITT)口葡萄糖耐量实验来评价F2代大鼠的胰岛素抵抗情况和糖耐量水平。同时用血糖仪分析F2代大鼠的空腹血糖水平,以及使用采用ELISA法分析空腹胰岛素、血液瘦素和脂联素水平,并通过血糖和胰岛素水平计算F2大鼠胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)。同时分析F2代GTT实验曲线下面积与F1代GTT曲线下面积及F1代水迷宫逃避潜伏期之间的关联性。结果：F2代大鼠的每窝死亡率也未受到FO代母鼠BPA暴露的影响。F2代各组组间的产仔数差异、性别比例以及仔鼠出生体重的差异均没有统计学意义(p>0.05)。同时与对照组F2代相比,BPA暴露组F2代在生长国产中各个时间点的体重和摄食量上也均无统计学差异(p>0.05)。BPA暴露组F2代大鼠与对照组F2代大鼠的空腹血糖、瘦素和脂联素之间的差异无统计学意义(p>0.05)。然而与对照组相比在F2代大鼠出生后第20周,BPA暴露组的空腹胰岛素水平明显升高(p<0.05)。通过计算胰岛素抵抗指数发现,BPA暴露组亦有明显升高(p<0.05)。同时,葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验的结果显示,BPA暴露组F2代大鼠,其的糖耐量水平和胰岛素耐量水平均明显下降(p<0.05)。同时F2代GTT实验曲线下面积与F1代GTT曲线下面积及F1代水迷宫逃避潜伏期之间不具有关联性。结论：F0代母鼠怀孕和哺乳阶段BPA暴露可以导致F2代糖耐量受损,出现胰岛素抵抗的症状。第二部分：F0代围产期BPA暴露对F2代能量代谢相关基因及肝脏Gck基因甲基化的影响目的：研究FO代母鼠怀孕和哺乳阶段BPA暴露对F2代大鼠能量代谢相关基因及肝脏Gck基因甲基化模式的影响。方法：将F0代孕鼠随机分为对照组和BPA暴露组,从受孕第0天开始分别进行玉米油和BPA (40μg/kg body weight/day)灌胃染毒。F1代雄鼠大鼠成年后与未受到过BPA暴露的成年雌性大鼠交配,以此产生F2代大鼠。采用荧光定量PCR法检测Gck, NR4A3, NR4A1, IRS-2and SREBP-1c等基因的相对表达水平。采用western blotting免疫印迹技术对发生mRNA表达发生改变的基因Gck,在其蛋白表达水平进行进一步的验证。使用总甲基化检测试剂盒检测地F2代大鼠肝脏总甲基化的变化,并通过亚硫酸盐直接测序地方法分析F2代大鼠肝脏Gck基因启动子区域甲基化的变化。同时分析F2代肝脏总甲基化与F1代GTT曲线下面积及F1代水迷宫逃避潜伏期之间的关联性。结果：BPA暴露组F2代大鼠的Gck基因表达水平与对照组相比(0.77±0.05vs1.00±0.06)显著性升高(p<0.05)。而NR4A3, NR4A1, IRS-2and SREBP-1c等胰岛素调控关键基因的相对表达水平在BPA组与对照组之间,没有显著地统计学差异(p>0.05)。F2代肝脏组织中Gck蛋白的表达水平与对照组相比也有明显的下降(p<0.05)。BPA暴露的F2代大鼠肝脏DNA的总甲基化水平(84.3±0.2%)发生了显著性地降低(p<0.05)。BPA暴露组的F2代大鼠肝脏中,Gck基因的12个CpG位点全部发生了甲基化的改变。而在对照组中CpG位点-314、-280、-93、-4和+5均是非甲基化的状态。同时,F2代肝脏总甲基化与F1代GTT曲线下面积及F1代水迷宫逃避潜伏期之间不具有关联性。结论：F0代母鼠怀孕和哺乳阶段BPA暴露可以导致F2代大鼠Gck基因表达水平下降及肝脏Gck基因甲基化模式的异常改变。第三部分：F0代围产期BPA暴露对F1代精子Gck基因甲基化的影响目的：研究F0代母鼠怀孕和哺乳阶段BPA暴露对F1代成年大鼠精子Gck基因甲基化模式的影响。方法：将FO代孕鼠随机分为对照组和BPA暴露组,从受孕第0天开始分别进行玉米油和BPA (40μ/kg body weight/day)灌胃染毒。F1代雄鼠大鼠成年后与未受到过BPA暴露的成年雌性大鼠交配后,提取其附睾组织并分离出精子。使用总甲基化检测试剂盒检测地F1代成年大鼠精子总甲基化的变化,并通过亚硫酸盐直接测序地方法分析F1代大鼠精子Gck基因启动子区域甲基化的变化。采用荧光定量PCR法检测Gck基因mRNA表达的变化。同时分析F1代精子总甲基化与F1代GTT曲线下面积及F1代水迷宫逃避潜伏期之间的关联性。结果：与对照组F1代大鼠(95.2±0.3%)相比,BPA暴露组的F1代大鼠精子中的DNA总甲基化水平(90.6±0.20%)也发生了显著性地降低(p<0.05)。Gck基因的5’端启动子区域的12个CpG位点,在BPA暴露组的F1代大鼠精子中全部发生了甲基化的改变。而在对照组的F1代大鼠精子中CpG位点-314则处于非甲基化的状态。然而分析结果表明,与对照组相比BPA暴露组F1代大鼠精子中的Gck基因表达水平并没有显著改变(p>0.05)。同时,F1代精子总甲基化与F1代GTT曲线下面积及F1代水迷宫逃避潜伏期之间不具有关联性。结论：F0代母鼠怀孕和哺乳阶段BPA暴露可以影响F1代成年大鼠精子总甲基化水平集Gck基因启动子区域的甲基化模式。