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第一部分:TAT-LMP-1融合蛋白的构建及其转导效率的测定
目的:目前研究中使用的各种LMP-1载体存在着不同的缺点,如转染效率低、细胞损害大、使用操作复杂等,因此有必要寻找更好的转运载体。蛋白转运结构域转运技术是近年发现并被广泛应用的蛋白转运技术,其具有安全、高效、操作简单、无细胞类型限制等优越性。本部分的目的是构建TAT-LMP-1融合蛋白,并对其进行扩增和纯化;测定构建的TAT-LMP-1融合蛋白的细胞转导效率,获取最佳转导时间,并将其用作后续实验的LMP-1转运工具,在探讨LMP-1分子功能的同时,观察该转运技术用于LMP-1实验研究以及临床应用的可行性和优缺点,为将来LMP-1的广泛研究和应用奠定基础。
方法:将构建好的pTAT-HA-LMP-1原核表达载体转化入大肠杆菌BL-21(DE3)中诱导表达和扩增,使用Ni-NTA亲和层析纯化系统纯化TAT-LMP-1蛋白,并用Western blot检测鉴定。使用NHS-荧光标记系统标记TAT-LMP-1,并用不同浓度的蛋白(0.05,0.1,0.25 nM)转导RAW264.7细胞,分别在15分钟、30分钟和60分钟终止转导,并使用流式细胞仪检测表达荧光的细胞的百分率,获得TAT-LMP-1的转导效率。
结论:本部分实验通过诱导和扩增表达以及系统纯化,成功制备了TAT-LMP-1蛋白。制备的TAT-LMP-1在37℃孵育30分钟,各实验浓度均能达到90%以上的细胞转导效率,且细胞内能检测到LMP-1的特异性高表达。本研究的后续部分均采用30分钟作为转导时间。
第二部分:TAT-LMP-1抑制破骨细胞前体活性的实验研究
目的:LMP-1是近年来发现和证明具有成骨诱导能力的蛋白。我们在研究LMP-1作用机制的过程中发现,LMP-1能抑制TNF-α和LPS诱导的破骨细胞前体合成和释放一氧化氮(NO)。而破骨细胞前体合成和释放NO是炎症反应和炎症性骨吸收早期阶段的重要表现之一。这一发现是对LMP-1功能的全新认识,过往的实验中均未对LMP-1抑制手术区和植骨区的局部炎症,从而促进局部成骨的潜在作用有所探讨。本部分的目的是探讨LMP-1抑制破骨细胞前体合成和释放NO的作用方式,以期进一步阐明LMP-1促进成骨和提高BMP-2反应性的作用机制。
方法:构建LPS诱导破骨细胞前体RAW264.7细胞合成和释放NO的细胞模型;将TAT-LMP-1转导入RAW264.7细胞内,使用MTT试验观察TAT-LMP-1的细胞毒性;在此模型上,利用Greiss反应检测NO的合成和释放,明确LMP-1抑制炎性反应的作用;使用RT-Real-time PCR、Western blot等方法检测一氧化氮合酶的RNA水平以及蛋白水平的基因表达,验证LMP-1抑制NO的合成和释放是否在基因转录水平。
结论:TAT-LMP-1在实验浓度范围内对细胞生存率无明显影响。LMP-1对破骨细胞前体的激活具有显著的抑制作用,体现在TAT-LMP-1对LPS诱导的破骨细胞前体释放炎症介质(NO)具有显著的抑制作用,而该抑制作用是发生在编码炎症介质的基因(iNOS)的转录水平。
第三部分:TAT-LMP-1抑制NF-κB信号通路及选择性调控MAPK信号通路的实验研究
目的:第二部分的研究结果表明,LMP-1对破骨细胞前体的活性具有显著的抑制作用,然而其分子机制需要进一步的阐明。NF-κB是公认的被致炎性因子激活并促进iNOS和其他炎症介质基因转录的信号通路,它不仅在在破骨细胞、破骨细胞前体的激活和功能中有重要作用,同时也是抑制成骨细胞分化和骨形成的重要信号转导通路。MAPK信号通路同样在炎症应激以及成骨细胞分化中具有相当重要的地位。因此,本部分的目的是探讨LMP-1对NF-κB和MAPK信号通路的影响,研究LMP-1抑制破骨细胞前体活性的分子机制。
方法:利用Western blot和磷酸化特异性抗体,检测NF-κB信号通路和MAPK信号通路中LPS刺激下各级蛋白激酶磷酸化情况以及LMP-1对磷酸化的影响。利用荧光素酶报告基因检测LMP-1对iNOS启动子和NF-κB转录活性的影响。
结论:LMP-1在LPS激活RAW264.7破骨细胞前体的细胞模型中,能有效抑制炎症反应中的核心信号转导通路NF-κB信号通路的激活。其分子机制为抑制IκB的磷酸化和IκB磷酸化导致的p65解离和核转移,从而抑制细胞核内p65水平的增高和对目标基因的调控。LMP-1的作用靶点位于关键步骤IκB的磷酸化的上游。LMP-1对RAW264.7破骨细胞前体中的MAPK具有选择性调控作用。