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第一部分：瘢痕疙瘩成纤维细胞DNMT1的表达及意义背景与目的：瘢痕疙瘩是整形烧伤外科常见的疾病之一,其发病机制与成纤维细胞的过度增生及胶原的大量无序沉积有关，其确切机制尚不完全清楚。DNA的甲基化与众多增生性疾病及纤维化性疾病的发病存在密切的联系，而瘢痕疙瘩的发病是否与DNA甲基化有关，瘢痕疙瘩甲基化相关因子的表达如何目前尚未见报道，因此，我们从表观遗传学的角度去探讨瘢痕疙瘩发生的另一种可能的机制-DNA甲基化，并且可能为瘢痕疙瘩的防治提供新的靶点与切入点。方法：收集53例瘢痕疙瘩患者手术切取的瘢痕疙瘩及其周围正常皮肤标本，并按生长期分为A（<6个月）、B（6~12个月）、C（1~2年）、D（>2年）4组；使用免疫组织化学法检测，比较各组标本正常皮肤、浸润部、增生部及老化部成纤维细胞DNMT1的表达差异；RT-PCR法检测各组标本及不同部位成纤维细胞DNMT1mRNA的表达。结果：DNMT1在成纤维细胞中主要分布于胞核内；瘢痕疙瘩成纤维细胞DNMT1蛋白阳性表达率及DNMT1mRNA表达均高于正常皮肤成纤维细胞（P=0.001）；瘢痕疙瘩生长期较短组成纤维细胞DNMT1阳性表达率及DNMT1mRNA表达均高于生长期较长组（P=0.007）；位于瘢痕疙瘩浸润部的成纤维细胞DNMT1阳性表达率及DNMT1mRNA表达均高于增生部与老化部（P=0.001）。结论：DNMT1在瘢痕疙瘩发病中具有重要作用；随着瘢痕疙瘩生长期的延长，DNMT1的表达有降低趋势；随着瘢痕疙瘩中部成纤维细胞老化，DNMT1表达降低。提示DNMT1在瘢痕疙瘩生长过程中起着重要的作用，并且与瘢痕疙瘩浸润生长密切相关。第二部分瘢痕疙瘩成纤维细胞系的建立及生长特性研究目的：通过实验条件的摸索构建瘢痕疙瘩成纤维细胞的原代培养方法，观察瘢痕疙瘩成纤维细胞的形态特征，初步研究瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长特性，培养足够的瘢痕疙瘩成纤维细胞为后阶段实验奠定坚实的基础。方法：采用单细胞法原代培养瘢痕疙瘩成纤维细胞并传代培养，摸索瘢痕疙瘩成纤维细胞生长的最佳环境及培养方法，在显微镜下观察瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长形态，采用MTT法测定瘢痕疙瘩成纤维细胞生长曲线。结果：原代培养后，约第3天可见瘢痕疙瘩成纤维细胞贴壁生长，传代时间在第15天左右；瘢痕疙瘩成纤维细胞形态如同梭形或星形，呈现漩涡状或者放射状的排列方式，MTT法测瘢痕疙瘩成纤维细胞生长曲线呈“S”型，瘢痕疙瘩成纤维细胞生长状态良好，可作为下一步实验的资源。结论：瘢痕疙瘩成纤维细胞的原代及传代培养过程顺利，细胞生长状态好，我们已成功构建瘢痕疙瘩原代及传代培养的整个体系，为我们下阶段的实验研究提供了保证。第三部分5-氮杂-2-脱氧胞苷对体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞生长周期及凋亡的影响背景与目的：近年来，对瘢痕疙瘩的发病机制及防治的研究越来越热，然而对于瘢痕疙瘩的防治仍是整形烧伤外科的一大难题，第一部分我们已经证实瘢痕疙瘩成纤维细胞存在DNMT1的高表达，因此，表观遗传学中的DNA甲基化的研究在瘢痕疙瘩的防治中可能有积极意义。本实验拟探讨甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷对体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞生长周期及凋亡的影响，进一步探讨瘢痕疙瘩与DNA甲基化的关系及寻找瘢痕疙瘩的治疗方法。方法：原代培养人体瘢痕疙瘩及正常皮肤成纤维细胞。使用甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷干预体外培养的瘢痕疙瘩及正常皮肤成纤维细胞，通过流式细胞技术检测细胞在干预前后细胞生长周期及凋亡的变化情况。结果：在同等条件下，瘢痕疙瘩成纤维细胞生长周期位于G0/G1期细胞数（P=0.035）及细胞凋亡数（P=0.006）较正常皮肤成纤维细胞低；5-氮杂-2-脱氧胞苷干预人瘢痕疙瘩成纤维细胞后，瘢痕疙瘩成纤维细胞停滞于G0/G1期比例增加（P=0.000），并且细胞凋亡率增加（P=0.047），而正常皮肤成纤维细胞组均无明显变化（P均>0.05）。结论：甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷可将体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞阻滞于G0/G1期，并且诱导细胞凋亡，进一步证明了瘢痕疙瘩的发生与基因的甲基化密切相关，甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷可能成为瘢痕疙瘩防治的新选择。第四部分5-氮杂-2-脱氧胞苷对体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞相关因子的影响背景与目的：前述研究发现瘢痕疙瘩的发生与DNA甲基化存在密切联系，并且甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷可抑制体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长并诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞的凋亡。因此，我们将进一步探讨甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷对瘢痕疙瘩成纤维细胞相关因子DNMT1、TGF-β1mRNA、Smad7mRNA的作用。方法：常规原代及传代培养人瘢痕疙瘩及正常皮肤成纤维细胞，使用甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷干预体外培养的瘢痕疙瘩及正常皮肤成纤维细胞，细胞干预时间为72小时，通过RT-PCR技术检测并比较瘢痕疙瘩及正常皮肤成纤维被药物干预前后DNMT1、TGF-β1mRNA及Smad7mRNA的表达水平差异。结果：体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞5-氮杂-2-脱氧胞苷干预组DNMT1、TGF-β1mRNA表达下降，Smad7mRNA表达回升，而正常皮肤成纤维细胞组无明显变化。结论：瘢痕疙瘩成纤维细胞DNMT1及TGF-β1表达高于正常皮肤成纤维细胞，而Smad7表达低于正常皮肤成纤维细胞，在5-氮杂-2-脱氧胞苷的作用下，瘢痕疙瘩成纤维细胞相关因子表达趋于正常，5-氮杂-2-脱氧胞苷可能成为瘢痕疙瘩治疗的新选择。