研究背景恶性肿瘤一直是威胁人类健康的重要原因之一。随着检测方法的日益改进,癌症早期诊断率逐渐增加。同时,随着治疗手段的提升和药品研发的飞速发展,女性恶性肿瘤患者的生存期逐渐延长,使得化疗对卵巢功能所造成的影响日益显现出来。卵泡储备对化疗十分敏感,化疗后短期可造成卵巢功能受损,长期可致生育率降低,早绝经风险明显增加,如潮热、失眠、骨钙流失等,这些严重影响了患者的生活质量,为此与卵巢功能保护相关的研究越来越多。现有的卵巢保护措施包括:卵巢组织冻存、胚胎或卵母细胞冻存、促性腺激素释放激素激动剂(GnRHa)以及干细胞治疗等。其中,干细胞治疗被认为是目前最有前景的治疗方法。干细胞能够不断进行自我更新,并且具有多向分化潜能。生理情况下能够替代衰老和凋亡的细胞,保证了机体组织结构的完整以及正常生理功能的发挥。病理情况下,能够抑制炎症反应,促进组织修复,有助于受损组织结构和功能的恢复。然而,干细胞治疗也存在一定潜在风险,例如,移植的细胞可能会引起血管栓塞、遗传物质发生突变、或造成机体肿瘤的发生,同时,干细胞的应用还存在伦理上的争议等。随着干细胞旁分泌物质外泌体的发现,人们逐渐将研究重心转向了干细胞分泌的外泌体。外泌体不仅具有来源干细胞的治疗效果,与干细胞相比外泌体更加安全稳定,并且具有良好的柔韧性和较高的细胞亲和力,不存在免疫排斥反应及伦理上的争议。越来越多的研究证实外泌体参与了许多生物学过程,包括调节免疫反应、维持体内平衡、凝血、炎症、血管生成和癌症进展。这些优势使得干细胞来源外泌体成为了一种非常有前景的无细胞治疗方法,在组织再生工程中被广泛关注。近年来,干细胞来源外泌体已经在神经系统、心脏疾病、肺损伤、骨缺损以及创伤等众多疾病中表现出了很好的组织损伤修复功能,但与卵巢功能保护的相关研究极少。为此,在本研究中首次选用人羊水间充质干细胞(human amniotic fluid stem cells,hAFSc),将其分泌的外泌体(exosomes derived from hAFSc,hAFSc-EXO)作为研究对象,探讨hAFSc-EXO在化疗所致卵巢功能损伤中的作用。研究目的寻找合适的分离方法制备hAFSc-EXO;建立顺铂诱导的卵巢颗粒细(GCs)体外损伤模型;探讨hAFSc-EXO在顺铂所致卵巢功能损伤中的作用,为进一步研究干细胞分子作用机制奠定基础。研究方法:第1部分:hAFSc-EXO的分离与鉴定1.收集孕中期孕妇的羊水,通过细胞形态进行分选,分离培养,获得纯化的hAFSc;2.流式细胞术检测hAFSc表面干细胞标志物。采用Western blot检测P3、P8代hAFSc表面Oct4、Nanog和SOX-2表达情况,评估不同代数hAFSc的干性;3.分别应用常规超速离心方法、浓缩后超速离心方法以及SBI外泌体提取试剂盒三种方式提取hAFSc-EXO,透射电镜下观察;4.Western blot检测外泌体富集蛋白的表达情况。第2部分:大鼠GCs的原代培养和顺铂诱导的体外损伤模型的建立1.应用孕马血清促进小月龄大鼠排卵,提取原代GCs;2.结晶紫染色观察GCs形态;3.免疫荧光染色鉴定GCs表面FSHR的表达;4.结晶紫染色观察不同浓度顺铂对GCs的损伤程度;5.CCK8评估顺铂对GCs增殖的影响,建立稳定的体外细胞损伤模型。第3部分:hAFS-EXO对顺铂诱导的GCs损伤的保护作用根据培养条件和作用试剂的不同,将实验对象分为3组:对照组、顺铂组和hAFSc-EXO组。对照组应用正常培养基培养细胞,加入无菌PBS。顺铂组应用含2.5mg/L顺铂的培养基培养细胞,加入无菌PBS。hAFSc-EXO组应用含2.5mg/L顺铂的培养基培养细胞,加入hAFSc-EXO与细胞共孵育。1.CCK8检测顺铂组和hAFSc-EXO组GCs增殖受抑制程度,从细胞增殖水平评估hAFSc-EXO对顺铂诱导的GCs损伤的影响;2.TUNEL法检测,从细胞凋亡角度评估hAFSc-EXO对顺铂诱导损伤的GCs的影响;3.Western blot检测3组细胞FSHR、Bax和Bcl-2表达情况,进一步评价hAFSc-EXO在卵巢功能、细胞凋亡中所起到的作用。研究结果:第1部分:1.通过细胞形态进行分选,从人孕中期羊水中可以获得纯化的h AFSc,显微镜观察可见细胞呈细长的纺锤形,细胞排列紧密;2.流式细胞术结果表明分离得到的h AFSc具有较强的干性,能够表达干细胞标志物CD29、CD90、SSEA、Oct3/4,同时具有低免疫原性,仅表达主要相容性复合体(MHC)I类分子蛋白HLA-ABC,不表达MHC II类分子蛋白HLA-DR,且不表达造血干细胞分子标志物CD34和CD45;3.Western blot结果显示P3、P8代h AFSc表面干细胞标志物Oct4、Nanog和Sox-2表达无明显差异,说明随着h AFSc不断扩增和传代,h AFSc仍然具有很好的干性;4.应用超速离心法,可以从无血清外泌体培养基中分离获得h AFSc-EXO,于透射电镜下观察,h AFSc-EXO为直径30-100nm的圆盘状小囊泡,具有典型的外泌体形态;5.分离提取的外泌体能够表达外泌体富集蛋白CD9、TSG101和LAMP1,h AFSc也可以表达同种蛋白,说明我们从培养基中分离获得的外泌体来自于h AFSc。第2部分:1.显微镜下观察,从大鼠体内分离提取的GCs具有和以往研究相同的形态,细胞呈多角形或星形,可见伪足,结晶紫染色结果相同;2.免疫荧光染色细胞核被染成蓝色,细胞核以外能够表达FSHR的部位被染成红色,结果发现细胞被染成弥漫的红色,说明GCs内的FSHR呈高表达,细胞活力良好;3.正常完全培养基培养48h,结晶紫染色见GCs生长旺盛,细胞融合达100%。2.5mg/L顺铂作用细胞48h,孔内的细胞减少,部分细胞坏死脱落。5mg/L顺铂作用48h,GCs坏死脱落明显;4.应用CCK8检测2.5mg/L和5mg/L顺铂对GCs增殖的抑制情况,结果两组细胞增殖均受到抑制,后者对细胞增殖抑制更加明显。2.5mg/L顺铂组24h增殖抑制率为30.69%±1.53%,48h增殖抑制率为48.86%±1.93%,5mg/L顺铂组24h增殖抑制率为54.69%±1.62,48h增殖抑制率为70.80%±1.96%。第3部分:1.2.5mg/L顺铂作用GCs 48h,CCK8检测各组细胞增殖抑制率,h AFSc-EXO组细胞增殖受抑制情况明显减轻,h AFSc-EXO组细胞增殖抑制率为38.4%±2.9%,顺铂组细胞增殖抑制率为49.7±1.9%;2.h AFSc-EXO组和顺铂组用含2.5mg/L顺铂培养基培养细胞48h后进行TUNEL检测,顺铂组中可见大量的凋亡细胞,而h AFSc-EXO组中凋亡的细胞很少;3.Western blot结果显示,与对照组相比,顺铂组和h AFSc-EXO组GCs的FSHR表达减少,抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低,促凋亡蛋白Bax表达增高,说明顺铂造成两组细胞功能受损,细胞凋亡增加。与顺铂组相比,h AFSc-EXO组GCs的FSHR、Bcl-2表达水平更高,Bax表达水平更低,说明h AFSc-EXO减轻了顺铂对GCs的损伤,抑制了细胞凋亡。研究结论1.通过细胞形态学分选,获得的h AFSc干性强,免疫原性低,且不具有造血干细胞成分;2.应用常规超速离心方法获得的h AFSc-EXO含量较多,杂质较少;3.用2.5mg/L顺铂可以建立稳定的GCs损伤体外模型;4.h AFSc-EXO能够减少顺铂诱导的大鼠GCs凋亡,降低顺铂对GCs增殖的抑制作用,改善卵巢功能。