目的:卵巢上皮性癌(简称卵巢癌)是妇科肿瘤领域中最具有挑战性的疾病,其死亡率居女性生殖道恶性肿瘤之首。卵巢癌高死亡率主要是因为该病在确诊时70%的患者是晚期,疾病的范围已经超过卵巢扩散到腹腔和腹膜后淋巴结,而晚期卵巢癌的五年生存率则长期徘徊在30%左右。与其他多种类型的癌不同,卵巢癌的主要转移途径不是通过血管,而是腹腔转移。由于在腹腔的广泛种植和转移常常引起严重腹水和肠梗阻,所以卵巢癌的腹腔转移是直接引起患者死亡的主要原因。因此深入了解调控卵巢癌腹腔选择性转移的机制十分重要,将对卵巢癌的治疗产生深远的影响。卵巢癌的腹腔播散转移特性除了与其解剖和机械的原因有关外,还主要是由于腹腔液中、腹水中存在和腹膜间皮细胞产生的趋化因子、生长因子、粘附因子等发挥了重要的作用。卵巢癌生长晚期,大网膜和腹膜是常见的转移部位。卵巢癌转移的目的地腹膜间皮细胞(human peritoneal mesohelial cells, HPMC)是脱落的肿瘤细胞腹腔播散时遇到的第一道防线,具有多种生理和病理功能。本课题组前期的研究发现,正常卵巢上皮无CXCL12及CXCR4蛋白表达,正常腹膜和腹腔液有CXCL12的表达,卵巢癌组织有CXCL12和CXCR4表达。目前已知CXCR4是趋化因子CXCL12的唯一生理受体,CXCL12又是CXCR4的唯一生理性配体,两者之间有非常高的亲和力。本课题拟通过构建稳定表达CXCR4卵巢癌细胞株及人腹膜间皮细胞的原代培养,到体外细胞实验,最后动物实验来证实这样由浅入深,层次递进的模式来探讨CXCL12-CXCR4生物轴在卵巢癌生长转移中的作用,从而更好的理解卵巢癌腹腔转移的机制,为抗卵巢癌腹腔转移的治疗寻找新的途径。方法:本课题分为三部分:1稳定表达CXCR4的卵巢癌细胞株的建立与鉴定及其增殖、迁移、侵袭能力的体外实验研究:首先将载体pReceiver-M02和目的基因CXCR4连接构建真核表达重组质粒pReceiver-M02-CXCR4,经双酶切和测序鉴定,结果证实正确。采用阳离子脂质体介导的转染方法,将高表达CXCR4的真核表达重组质粒pReceiver-M02-CXCR4及载体pReceiver-M02分别转染卵巢癌细胞SKOV3,经G418筛选并且通过单细胞分离技术获得了数个单细胞,转染成功的细胞经RT-PCR,Western blot和免疫细胞化学方法鉴定。将转染质粒、转染载体及未转染的三种卵巢癌细胞SKOV3进行体外培养。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法进行增殖实验,判断在无牛血清培养液的生长条件下,不同浓度的CXCL12对三种细胞增殖的影响以及CXCR4中和抗体和CXCR4拮抗剂AMD3100的抑制作用;以Transwell侵袭小室为模型,应用Matrigel探讨不同浓度的CXCL12对三种细胞迁移、侵袭的影响以及CXCR4中和抗体和CXCR4拮抗剂AMD3100的抑制作用。2人腹膜间皮细胞的原代培养及其对卵巢癌细胞黏附、迁移、侵袭力影响的体外实验研究:术中取无盆腹腔炎症、正常患者的大网膜。用0.25%胰酶+0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化大网膜组织,去除红细胞后培养;显微镜观察细胞形态变化;HE染色观察细胞形态并计算细胞纯度;扫描电子显微镜((SEM)观察细胞超微结构;免疫细胞化学法鉴定;粘附、迁移、侵袭体外实验观察腹膜间皮细胞对卵巢癌细胞生长转移能力的影响。3荷人卵巢癌细胞裸鼠腹腔移植瘤模型的建立及实验研究:转染质粒、转染载体和未转染的三种卵巢癌细胞进行体外培养。将裸鼠随机分为三组,每组各12只,分别将4×106个三种细胞注入每组裸鼠腹腔,自注入细胞后第二天起,将每组裸鼠又随机分为对照组和处理组,对照组腹腔内再注入生理盐水,处理组腹腔内再注入CXCR4拮抗剂AMD3100,同时每组均腹腔内注射CXCL12 0.2 ml,浓度为100ng/ml,每2天注射一次,连用2周共7次。裸鼠自然死亡后,观察腹腔成瘤数、体积、腹水量和存活期的变化。结果:1稳定表达CXCR4的卵巢癌细胞株的建立与鉴定及其增殖、迁移、侵袭能力的分析:目的基因CXCR4与载体pReceiver-M02的连接成功构建真核表达重组质粒pReceiver-M02-CXCR4后,进行DNA测序,结果证明顺序正确,其序列与GeneBank中人CXCR4基因(NM003467)的标准序列完全一致。确定G418的筛选浓度为600μg/mL。14 d后转染的卵巢癌细胞绝大部分死亡形成细胞岛,经有限稀释法获得了数个单细胞,将单细胞进行扩大培养。G418抗性筛选一个月后细胞仍继续生长,转染细胞的形态和生长速度未发生明显变化,伸展速度较未转染细胞慢。④将获得的稳定表达CXCR4卵巢癌细胞株通过RT-PCR、Western blot、免疫细胞化学三种方法进行鉴定,三种方法均表明CXCR4目的基因在卵巢癌细胞内表达,我们选取的11个单细胞扩大培养,通过上述三种方法鉴定,结果8个单细胞扩大培养后有CXCR4的阳性表达,转染效率平均为73%(8/11)。同时将转染真核表达重组质粒pReceiver-M02-CXCR4和转染载体pReceiver-M02的卵巢癌细胞分别命名为SKOV3/CXCR4和SKOV3/neg细胞。⑤MTT法观察100ng/ml CXCL12单独作用可促进SKOV3/CXCR4细胞的增殖,且能被10μg/ml CXCR4中和抗体和1μg/ml CXCR4拮抗剂AMD3100所抑制(F=256.89,P=0.000),100ng/ml CXCL12加入SKOV3/neg和SKOV3细胞中,增殖未发生明显变化,表明CXCL12-CXCR4生物轴相互作用方可促进卵巢癌细胞的增殖。⑥在无血清条件下,10ng/ml CXCL12促进SKOV3/CXCR4细胞的迁移;而100ng/ml CXCL12使迁移的细胞数明显增多,表明CXCL12对SKOV3/CXCR4细胞的迁移有明显的催化性,并随CXCL12浓度的增加迁移细胞数增多;10μg/ml CXCR4中和抗体和1μg/ml和CXCR4的拮抗剂AMD3100能够抑制100ng/ml CXCL12对卵巢癌细胞的趋化性迁移(F=702.6,P=0.003)。对于SKOV3/neg及SKOV3细胞,无论加入多大浓度的CXCL12都不能促进细胞的迁移(P>0.01),进一步表明CXCL12-CXCR4生物轴相互作用可促进卵巢癌细胞迁移,同时也表明CXCL12与CXCR4相互作用的相对特异性。⑦对于SKOV3/CXCR4细胞来说,当下室为无血清的培养液时,穿过Matrigel的细胞数很少(25.00±8.42),10ng/ml CXCL12作用后穿过Matrigel的细胞数目增多,100ng/ml CXCL12刺激后,穿过Matrigel的细胞数明显增多(56.00±9.23),两者相比有显著性差异(F=16.65,P=0.005),表明CXCL12对SKOV3/CXCR4细胞穿过Matrigel的侵袭性有趋化作用,并且随着CXCL12浓度的增加穿过Matrigel的细胞数增多;10μg/ml CXCR4中和抗体和1μg/ml CXCR4拮抗剂AMD3100,能够抑制CXCL12对卵巢癌细胞的趋化性侵袭;对于SKOV3/neg及SKOV3细胞,无论加入多大浓度的CXCL12穿过Matrigel的细胞数无明显变化,各组之间比较,无显著性差异(P>0.01)。2人腹膜间皮细胞的原代培养及其对卵巢癌细胞黏附、迁移和侵袭力影响的分析:分离培养的人腹膜间皮细胞为多角形,汇合时呈铺路石样排列,培养细胞的纯度达95%以上。SEM下见细胞表面大量的微绒毛。免疫细胞化学法显示:细胞角蛋白、波形蛋白抗原阳性,白细胞CD45、第Ⅷ因子相关抗原阴性,鉴定符合腹膜间皮细胞的特点。④氢化可的松(0.5% )、胰岛素(20μg/ml)对腹膜间皮细胞的生长有明显的促进作用。⑤免疫细胞化学法证实腹膜间皮细胞中表达CXCL12、间皮素,不表达CXCR4。⑥黏附、迁移、侵袭实验显示腹膜间皮细胞对卵巢癌细胞的转移能力有增强作用。3 CXCL12-CXCR4生物轴对荷人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤生长的影响:三组荷瘤裸鼠自然死亡后解剖腹腔显示无论是对照组还是处理组,均在腹腔形成移植瘤,成瘤率100%。各组裸鼠腹腔均有腹水形成,部分有血性腹水,腹水量相比没有显著性差异(F=48.09,P >0.05)。所有裸鼠盆腔、腹腔、网膜、肠系膜、腹壁多处有肿瘤结节,部分有肝脏、脾脏、子宫双附件转移,心脏、肾脏、肺脏未见转移。④三组裸鼠对照组的平均生存期相比有显著性差异(Z=-2.40,P<0.05),接种SKOV3/CXCR4细胞裸鼠处理组的平均生存期长于对照组,两者相比具有显著性差异(Z=-2.29,P=0.02)。⑤将腹腔内的移植瘤剪下,计数并称取重量。接种SKOV3/CXCR4细胞裸鼠的对照组腹腔移植瘤的平均个数为87.67±1.86 n,平均重量量是3.74±0.11 g,CXCR4拮抗剂AMD3100治疗组腹腔移植瘤的平均个数为80.17±4.58 n,平均重量是2.83±0.10 g,两者相比具有显著性差异(P<0.05);接种SKOV3/neg细胞裸鼠对照组腹腔内移植瘤的平均个数为79.17±2.32 n,平均重量为2.82±0.13 g,CXCR4拮抗剂AMD3100治疗组腹腔移植瘤的平均个数为79.83±3.25 n,平均重量为2.76±0.11 g,两者相比无显著性差异(P>0.05);接种SKOV3细胞裸鼠对照组腹腔内移植瘤的平均个数为78.16±1.17 n,平均重量为2.82±0.12 g,CXCR4拮抗剂AMD3100治疗组腹腔移植瘤的平均个数为77.67±3.33 n,平均重量为2.84±0.11 g,两者相比无显著性差异(P>0.05);三组裸鼠对照组腹腔移植瘤的个数和重量相比有显著性的差异(P<0.05)。结论:1稳定表达CXCR4的卵巢癌细胞株构建成功,并通过RT-PCR、Westernblot、免疫细胞化学三种方法鉴定,CXCL12-CXCR4生物轴在体外细胞水平可促进卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭。2胰酶+EDTA消化法是一种简单、有效的分离腹膜间皮细胞的方法。腹膜间皮细胞中表达CXCL12、间皮素,不表达CXCR4,腹膜间皮细胞对卵巢癌细胞黏附、迁移、侵袭有增强作用。3荷人卵巢癌细胞裸鼠腹腔移植瘤模型建立成功,并在体内动物实验水平进一步说明CXCL12-CXCR4生物轴可促进卵巢癌细胞增殖、侵袭能力。总结实验,我们可以推断,阻断CXCL12-CXCR4生物轴相互作用或某些细胞因子的表达可为肿瘤治疗提供新的途径。