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炎症和氧化应激引起的血管内皮损伤可使血管平滑肌细胞(VSMC)的生物学行为发生一系列改变,包括表型转换,异常增殖、迁移,并合成和分泌大量的细胞外基质。VSMC的这些变化是血管重构的细胞病理学基础,在高血压、动脉粥样硬化(AS)等多种心血管疾病的发生和发展中起到重要作用。因此,研究炎症和氧化应激引发VSMC异常增殖的作用机制及阻抑血管重构的有效靶点对心血管病防治具有重要意义。近年来,虽然防治心血管重构的新药不断涌现,并在临床上取得较好的疗效,但心血管新药还远远不能满足临床需要,研发效果好、副作用小、价格低的心血管新药仍是医药工作者面临的一项艰巨而光荣的任务。丹参是著名的心血管保护药物,在亚洲国家用于治疗心脑血管病已有数百年历史。现代药理学研究表明,以丹参素、丹参酚酸为代表的水溶性成分,以及以丹参酮为代表的脂溶性成分是丹参的主要活性成分,这些活性成分通过抗炎、抗氧化、改善内皮细胞功能等多种机制发挥对心脑血管的保护作用。我们实验室前期发现,丹参来源的mi RNA被小鼠或人体吸收后,可稳定地存在于人和动物的血清或组织中,与哺乳动物的内源性mi RNA相类似,调控不同靶基因的表达。然而,目前尚不清楚丹参来源的mi RNA是否也像丹参酮、丹参素等有效成分一样,通过抗氧化、抗炎等作用来阻抑血管重构及发挥对心血管保护作用。目的:探究丹参来源的Sal-mi R-58对血管重塑的抑制作用及相关机制。方法:1.通过结扎小鼠颈动脉建立血管内膜增生模型,将成年的雄性C57Bc L/6小鼠随机分成正常为结扎组、颈动脉结扎+control agomir组、颈动脉结扎+Sal-mi R-58 agomir组,采用免疫双荧光染色检测血管中p62的表达;ELISA检测小鼠血清中炎性因子水平;2.生物信息学预测Sal-mi R-58的靶基因,实时荧光定量PCR、免疫印迹、双荧光素酶报告基因分析确定OTUD7B是Sal-mi R-58的靶基因;3.筛选TNF-α作用于VSMC的最适浓度和最适时间后,免疫印迹分析、ELISA检测Sal-mi R-58对TNF-α诱导的炎性因子表达的影响;4.经蛋白质互作网络数据库http://genemania.org/预测与OTUD7B相互作用的蛋白质,免疫印迹分析、免疫双荧光染色、免疫共沉淀检测OTUD7B和E2F1的相互作用。5.根据http://gtrd.biouml.org/转录因子靶基因查询数据库GTRD预测受E2F1调控的靶基因,实时荧光定量PCR、免疫印迹分析检测OTUD7B和E2F1对p62表达的影响。结果:1.Sal-mi R-58抑制炎性反应,减轻颈动脉结扎诱导的血管内膜增生ELISA结果显示,颈动脉结扎组小鼠的血清炎性因子IL-1β、白细胞介素6(IL-6)和TNF-α水平显著高于对照组;原位转染Sal-mi R-58 agomir小鼠的IL-1β、IL-6和TNF-α水平显著低于未转染Sal-mi R-58 agomir的结扎组。免疫双荧光染色结果显示,结扎组血管内膜显著增生并且p62的荧光强度(绿色)显著增加。2.在VSMC中OTUD7B是Sal-mi R-58的靶基因,Sal-mi R-58抑制OTUD7B的表达根据测序结果提示KLF3、OTUD7B、SMAD5、USP20等可能是Sal-mi R-58的靶基因,在本研究中,我们选取了OTUD7B进行验证。生物信息学预测结果显示,OTUD7B 3’UTR含有Sal-mi R-58结合位点。为了明确Sal-mi R-58是否调节OTUD7B表达,我们用Sal-mi R-58转染VSMC后,检测OTUD7B的表达。免疫印迹实验结果显示,Sal-mi R-58显著下调OTUD7B蛋白表达水平。荧光素酶报告基因分析显示,Sal-mi R-58显著抑制OTUD7B 3’UTR驱动的荧光素酶活性。3.Sal-mi R-58靶向抑制OTUD7B表达,阻抑TNF-α诱导的VSMC炎症反应免疫印迹实验结果显示,TNF-α浓度依赖性的上调OTUD7B蛋白在VSMC中的表达水平。用Sal-mi R-58转染VSMC后再给予TNF-α刺激,OTUD7B、p62、NF-κB p65和NF-κB p50的上调被取消,同时,TNF-α诱导的炎性因子表达被抑制。4.OTUD7B通过使E2F1去泛素化而增加E2F1的稳定性经查询蛋白质互作网络数据库http://genemania.org/,我们发现OTUD7B可能与E2F1相互作用。由此推测,OTUD7B可通过使E2F1去泛素化而增加E2F1的稳定性。正如预期的那样,在VSMC中敲低或过表达OTUD7B,E2F1蛋白水平随之降低或升高。免疫荧光染色结果也显示,在VSMC中敲低或过表达OTUD7B后,E2F1的荧光强度随之减弱或增强,并且OTUD7B与E2F1在细胞核内共定位。Co IP结果表明,OTUD7B抗体的IP沉降物中可以检测到E2F1的存在;反之,E2F1抗体的IP沉降物中也可以检测到OTUD7B。这些结果说明,在VSMC中OTUD7B通过使E2F1去泛素化而增加E2F1的稳定性。5.Sal-mi R-58通过抑制OTUD7B表达导致E2F1下调,进而阻抑p62(SQSTM-1)表达及核因子κB(NF-κB)信号的活化根据http://gtrd.biouml.org/转录因子靶基因数据库,我们发现p62启动子区存在E2F1的结合位点。为此,我们检查E2F1对p62表达的影响。q RT-PCR结果显示,在VSMC中敲低或过表达E2F1后,p62的m RNA表达水平分别随之降低或升高。Western blotting结果显示,敲低或过表达OTUD7B后,p62蛋白水平也随之显著降低或增加。这些结果表明,OTUD7B-E2F1-p62调节途径参与Sal-mi R-58对VSMC炎症反应的调节过程。结论:1.Sal-mi R-58减轻颈动脉结扎诱导的血管炎性反应和血管内膜增生。2.在VSMC中,Sal-mi R-58通过靶向OTUD7B的3’UTR而抑制OTUD7B表达。3.Sal-mi R-58靶向抑制OTUD7B表达,阻抑TNF-α诱导的VSMC炎症反应。4.OTUD7B通过使E2F1去泛素化而增加E2F1的稳定性。5.Sal-mi R-58通过抑制OTUD7B表达而导致E2F1下调,进而阻抑p62表达及NF-κB信号的活化。