水体富营养化导致蓝藻水华的频繁发生已成为国内外普遍关注的水环境污染问题。蓝藻水华不仅污染水体、破坏饮用水源、造成渔业损失,而且多数蓝藻水华还由于产生蓝藻毒素(cyanotoxins)而影响和危害水生生物甚至人的健康。在众多蓝藻毒素中,微囊藻毒素(microcystins,MCs)是分布最广且毒性最强的一类环七肽肝毒素。目前已发现超过100种MCs异构物,它们具有广谱的生物毒性,且化学性质稳定,在自然水体中难以降解。因此,它们对人类健康的影响尤其令人关注。近年来,关于MCs对动物或细胞的毒性及其作用机制的探索已成为MCs毒理学研究的重点和热点。关于MCs的毒性作用及其机理研究虽然有很多新的发现和见解,但其作用的具体信号通路目前尚不完全清楚,而且存在一定的争议,而该问题的解决是进行MCs环境和健康风险评价的基础。本研究选择MCs异构体中最常见且毒性最大的微囊藻毒素-LR(microcystin-LR,MC-LR),以人肝癌细胞Hep G2作为实验模型,研究MC-LR对Hep G2细胞的毒性及其作用机制,以期进一步丰富和完善MC-LR肝细胞毒性作用机制理论、解析MC-LR毒性作用的危害及评价MC-LR的环境安全风险,为研究MCs对人类健康的影响及其防护提供理论支撑。研究内容及获得的主要实验结果:(1)MC-LR对Hep G2细胞的毒性作用及其特点本研究首先通过MTT实验检测细胞活力、流式细胞仪检测细胞周期和凋亡、倒置荧光显微镜检测细胞及细胞器形态,评价MC-LR对Hep G2细胞的毒性作用及其特点。实验结果显示,0.1 n M-10μM MC-LR短时间暴露未对Hep G2细胞的活力、细胞周期和细胞凋亡产生明显影响;而0.1-50 n M MC-LR处理Hep G2细胞96 h也未显著改变细胞活力。高浓度MC-LR(20-100μM)暴露Hep G2细胞却显著抑制细胞活力,并呈时间-剂量-效应关系。用0.5-50μM MC-LR暴露Hep G2细胞,倒置荧光显微镜镜检发现,高浓度MC-LR暴露改变Hep G2细胞形态、导致细胞损伤。Hoechst 33342染色后检测发现,一定浓度的MC-LR暴露导致细胞核损伤并诱导细胞凋亡。Acridine orange染色后检测发现,高浓度MC-LR暴露对细胞溶酶体造成严重损伤,且呈时间-剂量依赖效应关系。Rhodamine-123染色检测发现,较低浓度MC-LR暴露,部分Hep G2细胞线粒体出现轻微形态改变,但无明显结构损伤;而高浓度MC-LR长时间暴露后,Hep G2细胞线粒体损伤明显,且弥散性地分布在细胞内,这说明MC-LR暴露对Hep G2细胞的线粒体产生了损伤。该实验结果表明,MC-LR对Hep G2细胞的毒性具有浓度依赖性,非细胞毒浓度染毒对细胞活力无影响,而高浓度处理可导致细胞凋亡。(2)MC-LR对Hep G2细胞代谢及其耐药基因表达的影响由于0.1 n M-10μM MC-LR暴露Hep G2细胞24 h并未影响受试细胞的细胞活力、细胞周期和细胞凋亡。因此,我们首先要确定Hep G2细胞内是否表达MC-LR特异性转运体—有机阴离子转运多肽(OATP 1B1和OATP 1B3),并确定MC-LR是否真正进入到Hep G2细胞内。通过q PCR检测发现,Hep G2细胞内确实存在OATP1B1和OATP 1B3基因的表达。而通过Western blot技术并使用MC-LR特异性抗体检测,结果证实MC-LR可进入Hep G2细胞,且MC-LR处理浓度越高,检测到细胞内MC-LR特异性条带越强。MC-LR虽然可进入Hep G2细胞,但低浓度染毒并未对细胞表型产生影响。但进一步研究发现,MC-LR暴露引起Hep G2细胞I相和II相部分代谢酶及外排泵基因表达的改变,说明MC-LR染毒可能扰乱这些代谢酶的正常功能。因此推测Hep G2细胞代谢酶在MC-LR代谢和解毒过程中可能发挥作用。为了验证该假设,接下来我们使用CYPs诱导剂Omeprazole(OME)、Ethanol(ETH)和Rifampicin(RIF)处理Hep G2细胞,提高代谢酶活性以证实Hep G2细胞内代谢酶是否在MC-LR的代谢过程中发挥作用。实验结果显示,用5μM MC-LR染毒后,CYPs诱导剂影响Hep G2细胞活力,其中ETH的诱导作用最明显。由于ETH是CYP2E1特异性诱导剂,进一步通过CYP2E1抑制剂Chlormethiazole(CMZ)实验证实,MC-LR可通过上调CYP2E1表达或酶活性而诱导产生过量的ROS,并对Hep G2细胞产生毒性、引起线粒体损伤而导致细胞凋亡。通过ROS清除剂L-抗坏血酸与MC-LR共培养细胞,结果发现ROS清除剂能减少MC-LR诱导产生ROS及其诱导的细胞死亡。(3)MC-LR低浓度长期暴露对Hep G2细胞的影响已有研究表明,低浓度MC-LR长期暴露能促进细胞增殖并诱发肝炎/肝癌。为探究该机理,本研究进一步选择低浓度MC-LR(0.1-30 n M)暴露Hep G2细胞83 d。Western blot检测结果显示,即使极低浓度的MC-LR(0.1 n M)染毒后,该毒素也可有效地进入Hep G2细胞,但CCK-8检测并未发现MC-LR对细胞活力产生明显的影响。然而,通过DCF荧光分析结果显示,30 n M MC-LR暴露Hep G2细胞使其ROS水平较对照组显著上升;而5和10 n M MC-LR长时间暴露促进细胞SOD活性升高。该结果说明,低浓度MC-LR长时间暴露也能诱导细胞产生过量的ROS,而细胞内高活性SOD可能在清除过量ROS过程中发挥重要作用。采用0.1-30 n M MC-LR暴露Hep G2细胞48 h,对细胞NF-κB p65、TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平无明显影响;而MC-LR长时间暴露却显著提升细胞内NF-κB p65、TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平。(4)高浓度MC-LR处理致Hep G2细胞凋亡及其机理细胞毒性实验结果表明,高浓度MC-LR可通过诱导Hep G2细胞产生过量的ROS而对细胞产生毒性并导致细胞凋亡。为探究MC-LR诱导Hep G2细胞产生过量ROS导致细胞凋亡的信号途径,我们用10-50μM MC-LR暴露Hep G2细胞,检测后发现,Hep G2细胞内ROS水平上升、HSP70和HSP90表达增加、SOD和CAT活性降低、GSH含量降低,且较高浓度组与对照组差异显著。另外,Hep G2细胞MDA水平明显提高。该结果说明,高浓度MC-LR暴露诱导Hep G2细胞产生过量的ROS、引起细胞氧化应激,并导致细胞脂质过氧化程度加重。用0.5-50μM MC-LR暴露Hep G2细胞,通过Western blot和q PCR检测发现,Hep G2细胞线粒体相关的COX-2、Cyt-c和Smac/Diablo的表达上调;p53 m RNA水平上调,并使其蛋白磷酸化水平明显增强;p21/WAF1、Fas和Fas L表达水平普遍上调。MC-LR暴露还影响Hep G2细胞Bad、Cleaved-Bid、Bcl-2和Bax蛋白表达水平,促进Bax与Bcl-2表达。MC-LR暴露显著促进Hep G2细胞PUMA蛋白表达;而30和50μM MC-LR处理6 h抑制细胞survivin表达,随后多数浓度MC-LR处理组却促进survivin表达。另外,0.5-50μM MC-LR暴露还促进细胞Caspase-3和Caspase-9 m RNA水平提升和酶活性升高,而高浓度MC-LR暴露也促进Caspase-8的表达。本研究还发现,Hep G2细胞c-myc m RNA变化与MC-LR暴露浓度和时间有关,且MC-LR能促进c-Myc蛋白表达,高浓度MC-LR暴露24 h能增强Hep G2细胞c-Myc(phosphor S62)磷酸化水平。MC-LR暴露促进Hep G2细胞c-fos和c-jun转录和蛋白水平提升,说明MC-LR可能引起细胞DNA损伤并诱发遗传毒性,而c-myc、c-fos和c-jun可能在MC-LR促进肿瘤发展过程中发挥重要作用。(5)MC-LR肝细胞毒性的转录组学分析为进一步全面和系统地研究MC-LR细胞毒性的作用机制,本实验通过转录组学方法研究了不同浓度MC-LR暴露对Hep G2细胞转录组的影响。结果显示,0.5、5、10、和50μM MC-LR处理组Hep G2细胞与对照组细胞相比分别有532、32、30和984个基因发生极显著变化。通过GO分析发现,低浓度MC-LR(0.5μM)暴露影响Hep G2细胞的迁移、运动、细胞定位、细胞组分移动、磷酸化调节和磷酸盐代谢过程调节。而高浓度MC-LR(50μM)暴露影响Hep G2细胞差异表达基因显著富集到94个亚类,如细胞代谢调节、细胞生物合成调节、基因表达调控、磷酸化调节、激酶活性调节、免疫系统、MAPKKK通路调节、细胞增殖、分化、迁移、细胞运动、细胞坏死和细胞凋亡等。KEGG pathway分析结果显示,MC-LR暴露影响Hep G2细胞磷酸肌醇代谢、磷脂酰肌醇信号系统、NF-κB信号通路、p53信号通路和MAPK信号通路等重要信号通路。(6)MC-LR处理对Hep G2细胞mi RNA表达谱的影响虽然目前MCs毒性机理已有较多研究,但micro RNA(mi RNA)是否在MCs毒性过程发挥作用却报道甚少。本实验用不同浓度的MC-LR暴露Hep G2细胞后,通过高通量测序检测受试细胞mi RNA表达谱。实验结果显示,10μM MC-LR暴露显著改变Hep G2细胞mi RNA表达,其中5个上调、16个下调,共预测到37 566个靶基因;而50μM MC-LR处理组Hep G2细胞mi RNA表达显著上调的有20个、表达下调17个,共预测到39 174个靶基因。与对照组相比,10μM和50μM MC-LR处理组均引起Hep G2细胞has-mi R-149-3p、has-mi R-449c-5p和has-mi R-454-3p表达显著上调,引起has-mi R-4286、has-mi R-500a-3p、has-mi R-500a-5p和has-mi R-500b-5p表达显著下调。q PCR检测结果也验证了以上结果。MC-LR暴露Hep G2细胞引起差异表达mi RNA的靶基因共筛选出23个显著富集的GO条目,其中有3个在10μM和50μM MC-LR暴露组均显著富集。而KEGG pathway分析结果显示,MAPK信号通路、次生代谢产物的合成、嘧啶代谢和嘌呤代谢等信号通路可能在MC-LR对Hep G2细胞的毒作用过程中通过mi RNA负调节发挥作用。通过mi RNA表达谱分析还从Hep G2细胞中预测并筛选出了110个候选新mi RNA,进一步丰富了人类mi RNA数据库资源,并为后续的功能分析研究提供了基础支撑。本研究的主要结论:(1)MC-LR的暴露浓度及作用时间影响其对Hep G2细胞的毒性,而高浓度MC-LR处理可导致Hep G2细胞凋亡,且线粒体和溶酶体与该过程可能密切相关。(2)MC-LR可通过上调Hep G2细胞CYP2E1表达或酶活性而诱导细胞产生过量的ROS并对细胞产生毒性。(3)低浓度MC-LR长时间暴露可能会促发细胞的炎性反应。(4)高浓度MC-LR可通过诱导Hep G2细胞产生过量的ROS、激活线粒体细胞凋亡信号途径而介导细胞凋亡,PUMA和survivin在其中可能发挥重要作用。(5)高浓度MC-LR暴露也会激活Fas/Fas L死亡受体通路,并介导细胞凋亡。(6)MC-LR的肝细胞毒性作用由多种基因和蛋白参与、并由多条信号通路协同或拮抗而发挥作用。(7)mi RNA可能与MC-LR肝细胞毒性及其诱发的肝炎、肝癌有关,并可能在其中扮演重要的调控角色。本研究结果有助于从毒理学和分子水平揭示MC-LR导致易感人群患肝炎/肝癌的原因,为MC-LR安全风险评价和人类健康防护提供了理论支撑。