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苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是目前世界上用途最广、产量最大的微生物杀虫剂,其杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,简称ICPs)是转基因应用中最成功的杀虫活性蛋白。ICPs的结构域在昆虫的毒杀过程中起着重要的作用,然而对于ICPs各个结构域的功能及其与杀虫活性的关系的问题,一直是学术界争论的热点。如何从分子生物学角度充分的解释各结构域与功能的关系问题不论对基因的改造还是遗传重组都将起到不可估量的作用。蛋白转导结构域(Protein Transduction Domain,PTD)是一类能自动穿透细胞膜,并能作为载体将其它生物大分子携带进入细胞膜内的一段富含精氨酸的多肽,目前在医学中得到了广泛的应用。为验证杀虫晶体蛋白各结构域的作用,及Tat对各结构域的影响。本实验利用PCR的方法,合成9对引物扩增出各结构域及组合和包含Tat肽的各结构域及组合的共12个片段经连接、转化构建的阳性克隆子。经PCR、质粒单双酶切、测序证明已成功构建出了pET1AcI、pET1AcI-II、pET1AcI-II-III、pET1AcII、pET1AcII-III、pET1AcIII、pETT1AcI、pETT1AcI-II、pETT1AcI-II-III、pETT1AcII、pETT1AcII-III、pETT1AcIII等12个融合表达载体。构建的融合蛋白通过对IPTG诱导浓度、诱导时间、诱导温度进行表达条件优化,经SDS-PAGE凝胶电泳验证得到:当IPTG浓度为0.1mM、15℃诱导24h表达的蛋白含量最高。在优化的表达条件下12个融合蛋白:pET1AcI、pET1AcI-II、pET1AcII、pETT1AcI-II、pETT1AcII-III以可溶的形式存在。pET1AcI-II-III、pET1AcII-III、pET1AcIII、pETT1AcI、pETT1AcI-II-III、pETT1AcII、pETT1AcIII以包涵体的形式存在。以pETT1AcI-II-III为代表进行蛋白纯化条件的摸索,结果得出当咪唑浓度为40mM时可将靶标蛋白完全洗脱出来,并在此条件下纯化出pET1AcI蛋白。对表达的粗蛋白进行生物活性测定结果发现:各个结构域对小菜蛾均有杀虫活性但活性普遍较低只有全长的pETT1AcI-II-III较全长的pET1AcI-II-III有较高的杀虫活性,且杀虫活性达到了92.31%;含Tat的6个结构域蛋白较不含Tat的6个结构域蛋白杀虫活性增强,但总体杀虫活性增加不显著。各个结构域组合后杀虫活性并未呈现叠加效应,相反杀虫活性明显降低。