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目的课题组的前期研究表明,六味地黄丸能够抑制三阴性乳腺癌小鼠模型肿瘤的生长,抑制肿瘤转移,但抑制肿瘤转移的分子机制目前尚不清楚。本论文研究探讨了SOX2、MAP3K1沉默后,六味地黄丸对MDA-MB-231细胞迁移的影响,及对MDA-MB-231细胞中MAP3K1、SOX2、FOXD3、KLF4表达量的影响,从而进一步明确六味地黄丸抑制三阴性乳腺癌的转移分子机制。方法1、含药血清的制备:课题组选择SPF级成年SD大鼠,用六味地黄丸以低(1.07g/kg/d)、中(5.35g/kg/d)、高(10.70g/kg/d)的剂量进行灌胃三天后,麻醉后腹主动脉取血,分离六味地黄丸的含药血清。2、RNAi质粒的设计及筛选:SOX2-RNAi质粒的设计:上海吉凯公司完成SOX2-RNAi质粒的筛选:设计构建1个阴性质粒和3个SOX2位点的RNAi干扰序列,将它们瞬间转染进乳腺癌细胞MDA-MB-231中,6小时后观察转染情况,48小时后提取蛋白,测定蛋白表达量,表达下降最为明显的为沉默效果最好的质粒。3、细胞迁移分析:实时无标记细胞动态分析技术(Real Time Cellular Analysis,RTCA):将CIM-Plate16孔板放入RTCA DP监测台中,进行细胞迁移的实时动态监测(每15min检测一次,持续48h)。细胞迁移达到48h后停止实验,分析细胞迁移细胞指数(CI)曲线。4、沉默SOX2后含药血清对RTCA、蛋白表达影响:筛选沉默SOX2效果最好的质粒,加入含不同血清组的乳腺癌细胞MDA-MB-231的培养基中,用RTCA法测定细胞迁移,用蛋白印迹法检测乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞中MAP3K1、SOX2、FOXD3、KLF4蛋白水平的表达;用免疫荧光法检测乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞中MAP3K1、FOXD3、KLF4细胞定位及荧光量的表达情况。结果1、含六味地黄丸的血清(含药血清,下同)对MDA-MB-231细胞迁移的影响:(1)三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞迁移初步筛选:实时无标记法测定MDA-MB-231细胞迁移指数48h左右,结果显示:与20000、40000、80000个细胞数比较,60000个迁移指数最高,差异具有统计学意义(P<0.05),表明60000个细胞最适合后续实验。(2)含药血清对MDA-MB-231细胞迁移的影响:与对照组相比,六味地黄丸含药血清高、中、低剂量组及紫杉醇阳性药物组均能降低乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移能力,表明紫杉醇阳性药物组、含六味地黄丸的血清低剂量组、中剂量组、高剂量组对三阴性乳腺癌MDA-MB-231的迁移均有抑制作用,在六味地黄丸含药血清组中,以六味地黄丸高剂量组的抑制效果最好,差异具有统计学意义(P<0.05)。2、沉默SOX2后含药血清对MDA-MB-231细胞迁移的影响:(1)SOX2-RNAi质粒的筛选:蛋白印迹法筛选出四个质粒SOX2-RNAi位点的SOX2-RNAi(ID:69217-1)、SOX2-RNAi(ID:69218-1)、SOX2-RNAi(ID:69219-2)、阴性对照(ID:CON-313)均能沉默三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231中SOX2蛋白的表达,其中SOX2-RNAi-17(ID:69217-1)的沉默效果最好,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)沉默SOX2后,含药血清对MDA-MB-231细胞迁移的影响:与阴性质粒组相比,阳性质粒+紫杉醇组、阳性质粒+高、中、低剂量含药血清组的迁移指数均下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。与阳性质粒组相比,阳性质粒+紫杉醇组、阳性质粒+高、中、低剂量含药血清组的迁移指数均下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。3、沉默SOX2后,含药血清对MDA-MB-231细胞中MAP3K1、FOXD3、KLF4蛋白表达的影响:与阳性质粒组比较,对照组中SOX2的表达升高,阳性质粒+紫杉醇组、阳性质粒+高、中、低剂量含药血清组的SOX2蛋白表达均降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。与阴性质粒组比较,阳性质粒+紫杉醇组、阳性质粒+高、中、低剂量含药血清组的SOX2蛋白表达均降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。与阳性质粒组比较,对照组中MAP3K1的表达降低,阳性质粒+紫杉醇组、阳性质粒+高、中、低剂量含药血清组的MAP3K1蛋白表达量均升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与阴性质粒组比较,阳性质粒+紫杉醇组、阳性质粒+高、中、低剂量含药血清组的MAP3K1蛋白表达均升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。4、沉默SOX2后,含药血清对MDA-MB-231细胞中蛋白免疫荧光表达的影响:沉默SOX2后,含药血清对MDA-MB-231细胞中MAP3K1、FOXD3、KLF4免疫荧光表达的影响:沉默后的MAP3K1、FOXD3、KLF4在八组中均有不同的荧光强度。MAP3K1、FOXD3定位表达在细胞质跟细胞核中,以细胞质为主,KLF4以细胞核为主。与阳性质粒相比,对照组中MAP3K1的荧光强度降低,阳性质粒+紫杉醇组、阳性质粒+高、中、低剂量含药血清组的MAP3K1荧光强度均升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与阴性质粒组比较,阳性质粒+紫杉醇组、阳性质粒+高、中、低剂量含药血清组的MAP3K1荧光强度均升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1、构建的四个干扰位点对SOX2蛋白的表达均有降低作用,其中SOX2-RNAi-17的沉默效果最好。2、六味地黄丸对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞的转移有抑制作用,其中六位地黄丸高剂量组的抑制效果最好。3、沉默SOX2后,六味地黄丸能上调三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞中MAP3K1的蛋白表达,下调三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞中SOX2的蛋白表达,上调三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞中FOXD3的蛋白表达,上调三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞中KLF4的蛋白表达。所以六味地黄丸可以抑制三阴性乳腺癌的转移,很可能是通过调控MAP3K1、SOX2、FOXD3、KLF4的蛋白表达来抑制三阴性乳腺癌的转移。