论文部分内容阅读
研究背景股骨头坏死(Osteonecrosis of the femoral head,ONFH)是指股骨头内由于缺血改变造成股骨头内骨髓和骨细胞的变化,引起股骨头结构、功能的改变,导致髋关节受限的疾病,股骨头坏死同时具有极高的致残率。根据不同病因,可将股骨头坏死分为非创伤性和创伤性股骨头坏死,创伤性ONFH的病因包括明确的外伤史,是由外部条件造成的,而非创伤性ONFH又分为激素性股骨头坏死、酒精性股骨头坏死以及非特异性股骨头坏死。其中,由于临床工作中治疗其他疾病广泛应用激素,造成激素性ONFH发生的发病率占第一位,大部分患者往往合并有其他疾病,并且累及双侧股骨头发病,造成髋关节的严重受损,对患者的日常生活造成很大的影响。目前,关于激素性股骨头坏死发病的病理机制并不完全清楚,观点各不相同,国内外尚无有效的预防激素性股骨头坏死的方法。mi RNA对于干细胞分化影响的研究开始逐渐明朗,然而,miRNA与股骨头坏死关系的研究才刚刚开始,国内外的相关研究中关于运用miRNA双靶向基因调控的作用来预防和治疗激素性股骨头坏死的报道尚未见到。因此,本研究利用激素诱导大鼠模型,使用miRNA芯片检测的方法全面分析激素诱导对于miRNA表达的影响,从中选取了与股骨头坏死较为密切的mi RNA-27a进行研究。同时,又根据生物信息学分析,发现成脂基因PPARγ和成骨基因BMP-2拮抗剂GREM 1均为miRNA-27a的靶基因。本研究希望通过调控miRNA-27a的表达靶向调控PPARγ和GREM 1的表达,在有效的降低由于激素诱导产生的成脂分化作用的同时,促进其主动的成骨分化作用,对股骨头坏死初始环节的发病机制进行调控干预。所以,运用miRNA双靶向基因调控的作用,达到预防和治疗激素性股骨头坏死的科学研究更加具有创新意义。研究目的通过上调miRNA-27a的表达,靶向下调PPARγ和GREM 1的表达,观察其对于激素诱导大鼠BMSCs产生的成脂分化和成骨分化作用的影响。本实验研究由下三个部分组成:第一部分:激素诱导大鼠股骨头坏死中特异表达的miRNA分析方法(1)动物模型的建立:取SPF级雌性SD大鼠30只,随机分为模型组与对照组。模型组连续肌肉注射地塞米松磷酸钠(10mg/kg)。4周时取股骨头行常规石蜡包埋切片HE染色。(2)ONFH特异表达miRNA筛选:两组大鼠随机各取3个样本进行miRNA基因芯片分析。(3)miRNA基因芯片结果验证和相关基因表达检测:使用qRT-PCR检测激素诱导大鼠股骨头坏死模型中miRNA-27a和miRNA-182的表达水平,以及PPARγ、GREM1的mRNA表达水平,并对miRNA-27a与PPARγ和GREM1的表达水平进行相关性进行分析。(4)采用SPSS 21.0软件对数据进行处理,进行统计学分析。结果(1)4周时HE染色,结果显示:激素诱导模型组股骨头内骨小梁变细,稀疏、断裂、排列紊乱,骨小梁面积明显减少;正常对照组股骨头内骨小梁结构完整,无断裂。(2)miRNA基因芯片检测结果显示:激素诱导大鼠股骨头坏死模型组与对照组相比较,miRNA表达明显上调达3倍以上的有9个,表达明显下调达3倍以下的有28个。(3)qRT-PCR检测结果显示:miRNA-27a的表达在模型组中明显下调,miRNA-182则明显上调(P<0.05)。(4)与对照组比较,模型组的PPARγ和GREM1的mRNA表达水平均明显上调(P<0.05)。(5)相关性分析结果显示:PPARγ和GREM1的表达水平与miRNA-27a均呈现负相关(R~2=0.717、R~2=0.662)。第二部分:上调miRNA-27a对激素诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化的影响方法(1)大鼠BMSCs制备:分离培养大鼠BMSCs,流式细胞仪行表面抗原CD29,CD34、CD45、CD90鉴定。(2)激素诱导BMSCs分化实验:对激素诱导大鼠BMSCs进行油红“O”染色,检测甘油三酯的含量,检测骨钙素含量及细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性。分别用qRT-PCR和Western blot检测激素诱导大鼠BMSCs中与成脂、成骨相关蛋白PPARγ、GREM1、Runx2、BMP-2、C/EBPα的表达水平。(3)miRNA-27a影响激素诱导BMSCs分化实验:转染miRNA-27a agomir上调激素诱导大鼠BMSCs中miRNA-27a的表达水平,qRT-PCR检测大鼠BMSCs中miRNA-27a的表达水平;分别用qRT-PCR和Western blot检测大鼠BMSCs中与成脂、成骨相关蛋白PPARγ、GREM1、Runx2、BMP-2、C/EBPα的表达水平。对上调miRNA-27a的BMSCs进行油红“O”染色以及碱性磷酸酶染色,检测甘油三酯的含量、骨钙素含量及细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性。(4)采用SPSS 21.0软件对数据进行处理,进行统计学分析。结果(1)流式细胞仪术结果显示:第3代大鼠BMSCs的CD29、CD90的阳性率为99.84%、99.41%;CD34、CD45的阳性率为1.29%、1.42%。(2)激素诱导BMSCs分化实验结果显示:激素诱导大鼠BMSCs14天,模型组BMSCs的油红O染色出现大量脂滴。模型组中的甘油三酯含量在7天和14天时均明显高于正常对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。模型组中的碱性磷酸酶及细胞培养基中骨钙素含量在7天和14天时均明显低于正常对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。经激素诱导的模型组大鼠BMSCs在7天和14天时PPARγ、GREM1、C/EBPα的表达显著高于正常对照组,且两组差异具有统计学意义(P<0.05)。Runx2、BMP-2的表达和miRNA-27a的表达均明显低于正常对照组,且两组差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)miRNA-27a影响激素诱导BMSCs分化实验结果显示:在模型组和无关对照组中PPARγ、GREM1和C/EBPα的表达均显著高于miRNA-27a组和正常组,差异具有统计学意义(P<0.05);在模型组和无关对照组中Runx2、BMP-2的表达则显著高于其他两组,差异具有统计学意义(P<0.05)。模型组和无关对照组的大鼠BMSCs油红O染色中可见大量脂滴,而miRNA-27a组和正常对照组中量均极少。miRNA-27a组和正常对照组的大鼠BMSCs碱性磷酸酶(ALP)染色中均可见大量细胞胞浆染色为蓝/紫色,而模型组和无关对照组中量均极少。miRNA-27a组和正常对照组的大鼠BMSCs的甘油三酯含量均明显低于模型组和无关对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。miRNA-27a组和正常对照组的大鼠BMSCs的碱性磷酸酶活性(ALP)及骨钙素含量均明显高于模型组和无关对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。第三部分:miRNA-27a调控激素诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化机制的初步研究方法(1)生物信息学分析预测靶基因:用TargetScan和miRBase软件分析预测miR-27a的靶基因。(2)miRNA-27a靶基因鉴定:构建pmirGLO-PPARγ和pmirGLO-GREM1重组报告基因载体,与转染miRNA-27a agomir与miRNA-27a scramble共转染入大鼠BMSCs中,通过双荧光素酶报告证实miRNA-27a的作用靶标。(3)上调miRNA-27a与沉默靶基因对激素诱导BMSCs分化作用比较:实验分为5组,为空白组(大鼠BMSCs);模型组(大鼠BMSCs+地塞米松);miRNA-27a组(miRNA-27a转染BMSCs+地塞米松);si-PPARγ组(si-PPARγ转染BMSCs+地塞米松);si-GREM1组(si-GREM1转染BMSCs+地塞米松)。分组转染24小时后,qRT-PCR检测miRNA-27a的表达水平。BMSCs培养14天,分别用qRT-PCR和Western blot检测各组大鼠BMSCs中与成脂、成骨相关蛋白PPARγ、GREM1、Runx2、BMP-2、C/EBPα的表达水平。BMSCs培养14天,对各组BMSCs进行油红“O”染色和碱性磷酸酶染色;进行甘油三酯测定检测;ELISA检测各组细胞培养基中骨钙素含量以及细胞内碱性磷酸酶活性。(4)采用SPSS 21.0软件对数据进行处理,进行统计学分析。结果(1)TargetScan和miRBase生物信息学分析预测结果显示:PPARγ和GREM1是mi RNA-27a的作用靶点。(2)双荧光素酶报告实验的结果显示:miR-27a通过作用于PPARγ和GREM1的3’UTR区,可以到达负向调控其表达的作用。(3)大鼠BMSCs转染mi RNA-27a的鉴定结果示:miRNA-27a组中miRNA-27a表达水平显著增高,并明显高于其他4组,差异具有统计学意义(P<0.05)。(4)BMSCs培养14天,模型组和si-GREM1组中PPARγ的表达均显著高于正常组、si-PPARγ组和miRNA-27a组,差异具有统计学意义(P<0.05);模型组和si-PPARγ组中GREM1的表达显著高于正常组、si-GREM1组和miRNA-27a组,差异具有统计学意义(P<0.05);空白组、si-GREM1组和miRNA-27a组中Runx2的表达则明显高于si-PPARγ组和模型组,差异具有统计学意义(P<0.05);模型组和si-PPARγ组中BMP-2的表达明显低于正常组、si-GREM1组和miRNA-27a组,差异具有统计学意义(P<0.05);模型组和si-GREM1组中C/EBPα的表达显著高于正常组、si-PPARγ组和mi RNA-27a组,差异具有统计学意义(P<0.05)。(5)BMSCs培养14天,油红“O”染色显示:模型组和si-GREM1组的大鼠BMSCs中可见大量脂滴。而正常对照组、si-PPARγ组和miRNA-27a组中量均极少。碱性磷酸酶染色显示:正常对照组、si-GREM1组和miRNA-27a组的大鼠BMSCs可见大量细胞胞浆染色为蓝/紫色,而模型组和si-PPARγ组中量均极少。(6)BMSCs培养14天,正常组、si-PPARγ组和miRNA-27a组的大鼠BMSCs的甘油三酯含量均明显低于模型组和si-GREM1组,差异具有统计学意义(P<0.05)。(7)BMSCs培养14天,正常组、si-GREM1组和miRNA-27a组的大鼠BMSCs的碱性磷酸酶活性(ALP)及细胞培养基中骨钙素含量均明显高于模型组和si-PPARγ组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论(1)激素诱导大鼠股骨头坏死模型中,mi RNA-27a的表达是显著下调的,PPARγ和GREM1的表达明显上调,并且miRNA-27a的表达与PPARγ和GREM1的表达呈负相关性。(2)上调miRNA-27a的表达可以有效的抑制激素诱导大鼠BMSCs的成脂分化作用,同时可促进成骨分化。(3)miRNA-27a通过作用于PPARγ和GREM1的3’UTR区,负向调控其表达,在激素诱导大鼠BMSCs的分化过程中发挥作用。