猪视黄醇结合蛋白基因的转录、诱导转录及真核表达研究

来源 :东北农业大学 | 被引量 : 11次 | 上传用户:luo_123
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视黄醇结合蛋白(Retinol-Binding Proteins,RBPs)是体内一类将维生素A(VA)从肝中转运至靶组织以实现VA的细胞内转运代谢的特异的运载蛋白,在协助VA发挥生理功能中起着不可替代的作用。它先与VA结合再与甲状腺素运载蛋白(transthyretin,TTR)结合形成VA-RBP-TTR复合体,经血液流经靶组织后,与RBP的可识别受体(Retinoic acid receptor,RAR;retinoid X receptor,RXR)结合后,将VA转运至细胞内的受体,至此RBP完成其运载功能。RBP4既是一个影响猪的繁殖性状的候选基因,同时也是一个研究VA代谢障碍的候选基因。本研究以不同日龄大白猪为研究对象,采用RT-PCR法研究了RBP4 mRNA、RARs mRNA、RXRs mRNA和TTR mRNA在心脏、肝脏、胃、脾、肾脏、肺、大肠、小肠、肌肉、子宫和卵巢的转录情况;以猪的成纤维细胞系为研究对象,采用RT-PCR法研究了添加过量的VA后,RBP4 mRNA、RARs mRNA、RXRs mRNA和TTR mRNA的转录变化情况;采用ELISA和HPLC法检测了血清中RBP和VA的含量及与1月龄仔猪体重的关系;采用毕赤酵母真核表达系统构建了可被甲醇诱导表达的载体,主要研究结果如下:1.RBP4 mRNA在大白猪的脾脏和胃中不转录;在肝脏中是持续高转录;子宫中的转录水平在不同日龄间差异显著(P<0.05),且在90日龄时最低;卵巢中的转录情况是随着日龄的增加,转录水平也逐渐增加,180日龄时(性成熟期)达到最高,而后开始下降,至360日龄时最低。在心脏、肾脏、肺、大肠、小肠、肌肉也转录,但存在空间和时间的特异性。2.RARa mRNA在大白猪的肝脏、脾脏、肾脏、大肠、小肠、子宫和卵巢中持续转录,其中脾脏、大肠和小肠是持续高转录;180日龄时,所有组织的RARαmRNA的转录量普遍降低;360日龄时,所检的11个组织均高转录该基因。RARβmRNA在大白猪的心脏、肾脏、大肠、子宫和卵巢中持续转录,其中大肠、子宫和卵巢是持续高转录,在1日龄和360日龄的时候,所检的11个组织均转录该基因,且转录量较高;因RARβmRNA在子宫和卵巢的持续高表达,也可以考虑将其作为一个影响繁殖性状的候选基因来加以研究。RARγmRNA在大白猪的子宫和卵巢中持续转录,子宫中该基因的转录量一直持续较高,在360日龄时所检的11个组织均转录该基因,且转录量较高。3.RXRαmRNA在大白猪的肾脏、肺、小肠和肌肉组织中持续转录,而在心脏和子宫转录水平较低,1日龄时转录RXRαmRNA的组织最多,同时转录量也最高。RXRβmRNA在大白猪的脾脏、子宫和卵巢中持续转录,也是在1日龄时转录的组织最多且转录水平较高。RXRγmRNA在大白猪的心脏、脾脏、大肠、小肠和肌肉组织中持续转录,并且转录量一直持续较高,而肾脏不转录该基因。4.TTR mRNA在大白猪的肝脏、子宫和卵巢持续转录,且在肝脏中持续高转录,这与RBP4 mRNA的转录情况一致;1日龄时所检的11个组织均转录,且转录量较高,而90日龄时除了心脏、肝脏和胃外,其余组织的转录水平均较低。5.根据分析不同日龄不同组织中RBP4 mRNA的变化规律与RARs和RXRs mRNA的变化规律,推测出了所检的11个组织中,每个组织内可能与RBP4结合的核受体类型。6.在猪的成纤维细胞系中添加过量的VA后,在24-72h内可正调节RBP4 mRNA的转录;在72h的培养期内,RARα、RARβ和RARγmRNA的转录变化均是在12h和48h时最高,24h和72h时最低,但总体基本都处于对照组之下,也就是说过量的VA会负调节RARs mRNA的转录;与对照组相比,过量的VA正调节了RXRγmRNA的转录,而负调节RXRα和RXRβmRNA的转录。7.血清中RBP和VA的含量存在显著相关(P<0.01),但不存在线性关系;血清中RBP和VA的含量与1月龄体重均不存在显著性相关(P>0.05)。8.从大白猪的肝脏组织的cDNA中,PCR扩增出猪RBP4成熟蛋白编码核苷酸序列,产物全长549bp,即为猪RBP4成熟蛋白183个氨基酸序列。9.构建了大白猪RBP4成熟蛋白编码序列的真核转录载体pPICZaC-RBP4,经PCR、酶切和测序检测分析,片段大小与理论相符,证明构建成功。10.成功的利用甲醇诱导真核转录质粒pPICZaC-RBP4在GS115酵母菌中的表达,并在蛋白水平上检测到了RBP4成熟蛋白的表达。
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