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在所有的骨架蛋白家族中,Kinesin蛋白构成最大的家族,Kinesin是三大骨架动力蛋白的其中一种,该蛋白会沿着微管作运动,运动的能量来源是ATP水解释放的能量,Kinesin家族的成员有氨基酸序列(大约350个,且都很保守)和一个微管结合域(依赖于核苷酸),按照其微管结合域的序列同源性将其分为14个亚家族。kinesin-12是14个亚家族中的一族,该蛋白是一种微管驱动蛋白,Kinesin-12a和kinesin-12b是kinesin-12基因的T-DNA不同插入位点的突变体,该蛋白被定位在成膜体的两个反向平行的微管之间,目前对该基因的研究仅在细胞有丝分裂过程中。
减数分裂,是只有在有性生殖细胞中才具有的独特的细胞分裂方式,在整个分裂过程中细胞内的DNA复制一次,细胞要进行两次分裂。对于生物体的有性生殖过程,减数分裂是必不可少的,它可以保证每种生物前代与后代体细胞内染色体数目的恒定,通过减数分裂过程,母本体内的基因遗传到子代体内,这样可以使上代的生物性状能得到遗传;同时在此过程中,基因有可能发生突变,因此又会出现变异,这样既确保了生物的多样性,又增强了生物适应千变万化的外界环境的能力。
本研究以野生型拟南芥和kinesin-12a1/12b2(双突变体)为实验材料,通过鉴定突变体、克隆基因、并构建微管和微丝GFP融合表达载体,分别转化野生型及突变体拟南芥,得到阳性转基因植株、分析该突变体的表型、观察比较野生型拟南芥和突变体的花药并鉴定其花粉活力、比较其花药的小孢子母细胞减数分裂各时期染色体的行为,主要结果如下:
1.微管微丝GFP融合表达载体经过序列测定及比对结果说明表达载体构建成功。
2.突变体经过鉴定,确定为纯合突变。
3.kinesin-12a1/12b2在营养生长阶段出现早花现象,在生殖生长阶段,其植株矮小,叶片较窄,以及角果较短小,野生型拟南芥的种子败育率接近21%,而kinesin-12a1/12b2的种子败育率接近63%,突变体的种子出现异常。
4.TTC花粉染色法统计野生型拟南芥的花粉败育率为19%,而kinesin-12a1/12b2的花粉败育率接近72%,共聚焦显微镜观察拟南芥野生型和突变体的成熟花粉粒,分别观察了30个,野生型拟南芥的花粉粒有两个细胞核,大的为营养核,小的为生殖核,而突变体的花粉粒中只有一个核,其中野生型正常的花粉粒有23个,kinesin-12a1/12b2突变体的单核花粉粒有19个,进一步表明,kinesin-12基因会影响拟南芥雄配子体的发育。
5.扫描电镜结果表明,野生型拟南芥的花药呈饱满突起的形态,而kinesin12a1/12b2突变体的花药多数呈现干扁的形态,由此推测,kinesin-12基因会影响花药的发育。
6.DAPI染色结果表明,Kinesin-12a1/12b2突变体小孢子母细胞中期Ⅰ和后期Ⅰ的染色体出现异常,有落后染色体和染色体桥的现象出现,由此推测该基因可能参与减数分裂过程,并且在分裂中期和后期起作用,在该基因的突变体中,微管在分裂中期和后期不能形成正常的纺锤体和成膜体,进而不能调控分裂中期和后期染色体的运动,致使中期和后期染色体出现异常,初步推测,该基因的功能是参与微管形成纺锤体和成膜体。
7.激光共聚焦显微镜观察野生型及突变体的胚囊,结果发现在野生型的胚囊中能看到细胞核,但是在突变体的胚囊中则很少看到有活细胞的存在。说明,kinesin-12基因可能会影响拟南芥的雌配子体发育。
8.间接免疫荧光标记结果表明,突变体的小孢子母细胞在分裂中期提早出现极丝微管,但是在理论上,正常的细胞中,极丝微管是在分裂后期出现的,推测,该基因的功能之一是在分裂中期抑制极丝微管的形成。