肝纤维化的本质是肝脏细胞外间质纤维生成和降解失平衡的结果,而活化的肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)是细胞外基质的主要来源,HSC的活化、增殖是肝纤维化发生的中心事件。HSC的活化是肝纤维化发生发展的关键环节,与静止及过渡期的HSCs比较,活化的HSCs能高水平表达I型胶原和基质金属蛋白酶抑制因子l,在肝纤维化形成过程中,HSC数量是增多的;而在肝纤维化的逆转过程中其数量是减少的。当前,抗肝纤维化治疗主要策略是减少活化HSC总数量,而实现这一目的的主要途径有二个:一是将活化的HSCs逆转为静止的;二是促进活化HSCs凋亡,使其总体数量减少。由于HSC的活化是个不连续的多阶段过程,将活化的HSCs逆转几乎是不可能的,因此,减少HSC活化、增殖,促进HSCs凋亡,减少其数量,减少ECM,成为肝纤维化治疗的主要策略。HSCs不仅是肝脏炎症过程的靶细胞,更是炎症的效应细胞,这一观念的改变,代表着肝纤维化研究领域的最新进展。NF-κB (nuclear factor kappa B)及其调控系统是介导炎症反应的关键调节因子。在肝纤维化形成过程中,枯否氏细胞(Kupffer cell,KC)可以被细胞变性、坏死释放的脂质过氧化物、细胞因子等炎性介质激活而分泌大量的细胞因子、趋化因子等促炎介质及活性氧等,这些物质可启动或加剧肝脏炎症反应。NF-κB作为炎症反应最为重要的转录因子,对KC分泌上述介质进行调控。肝损伤时由于肠道细菌和肠壁通透性增加,门脉系统和血液循环中的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)水平增加,后者通过HSC TLR4受体活化NF-κB。活化的HSCs内NF-κB活性增强,导致炎性因子表达增加,放大肝脏炎症损伤反应,促进了HSC的活化;与此同时,NF-κB在细胞凋亡中发挥重要作用,NF-κB能抑制多种类型的细胞凋亡。NF-κB活性增强可减少HSC凋亡,促进其活化、增殖及移动。因此,通过抑制NF-κB活性,对减少HSC活化,促进HSC凋亡,减少ECM,有重要作用,将有可能成为逆转肝纤维化新策略,并将产生重大影响。本研究通过小干扰RNA (short interfering RNA, siRNA)技术抑制HSC NF-κB基因及其对促进活化的HSC凋亡,凋亡机制以及ECM代谢的影响,证明了抑制NF-κB活性可促进活化HSC凋亡,减少ECM合成,加强其降解,从而有利于抗肝纤维化治疗;以此为启发点,进一步研究了双环醇对NF-κB活性的抑制作用,探讨了其对促进活化HSC凋亡作用的影响、作用机制及对活化HSC ECM代谢的调节作用,为双环醇用于抗肝纤维治疗提供了理论依据;本研究还探讨了双环醇对四氯化碳引起的急性肝损伤保护作用机制与NF-κB关系,证实双环醇可通过抑制NF-κB活性,减少氧应激,减少炎症因子的表达,保护肝细胞,减少HSC活化,从而有利于肝纤维化的防治。第一部分:靶向NF-κB的小干扰RNA诱导肝星状细胞凋亡作用、分子机制及对ECM代谢的影响目的: NF-κB通路在肝星状细胞凋亡调控中起重要作用,抑制NF-κB活性的药物可促进HSC凋亡,逆转实验性肝纤维化,本文应用小分子干扰RNA技术沉默NF-κB p65基因,观察其对HSC凋亡、凋亡机制和ECM的影响。方法:选用阳离子脂质体Lipofectamine 2000作为转染试剂,将针对NF-κB p65亚基的siRNA转染HSCs-T6细胞72h后,再与脂多糖LPS孵育1h,然后实时荧光定量PCR法检测转染细胞中NF-κB p65、I型前胶原、TIMP-1、α-SMA、TGFβ1和抗凋亡蛋白A1 mRNA表达, Western blot检测NF-κB p65和Bcl-2蛋白表达,酶谱法检测MMP-2活性,流式细胞术、TUNEL及caspase-3活性检测细胞凋亡。结果:①NF-κB siRNA转染对HSC-T6细胞NF-κB表达的影响:Westernblot分析显示,LPS作用于HSC-T6后,NF-κB p65蛋白表达量明显高于空白对照组(2.34±0.26 vs 0.62±0.11),升高了277.42%,P<0.01;NF-κB siRNA转染HSC-T6 72h后,NF-κB p65蛋白表达量显著降低,较scramble siRNA组降低(85.12±5.10)% (P<0.01),实时荧光定量PCR法检测结果也显示在NF-κB siRNA转染HSC-T6细胞72h后,NF-κB mRNA表达水平下降,较scramblesi RNA组降低(86.34±1.01)%,上述结果表明本研究构建的NF-κB siRNA转染可在蛋白和转录水平抑制NF-κB表达,抑制其功能。②NF-κB siRNA转染对HSC-T6细胞凋亡的作用:NF-κB调控着多种凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的转录,因而对多种细胞的凋亡具有抑制作用,为此,我们用多种方法研究了NF-κB siRNA对HSC-T6细胞凋亡的作用。流式细胞仪检测结果显示:NF-κB siRNA转染HSC-T6 72h时,细胞凋亡率增高至(15.40±0.90)%,而scramble siRNA组细胞凋亡率仅为(1.69±0.55)% (P<0.05)。应用TUNEL法检测细胞凋亡进一步证实此结果,凋亡细胞细胞核内可见棕褐色染色颗粒,NF-κB siRNA转染组棕褐色染色颗粒明显高于scramble siRNA组,上述结果证实NF-κB siRNA转染具有促进HSC-T6细胞凋亡作用。Caspase-3是调节细胞凋亡的关键蛋白质。我们研究结果显示NF-κB siRNA转染HSC-T6 72h时Caspase-3活性增高至0.117±0.102,与空白对照组、LPS组、脂质体组、scramblesiRNA组之间有显著性差异,P<0.01,有统计学意义。③NF-κB siRNA转染对抗凋亡蛋白Bcl-2和A1蛋白的作用:Bcl-2和A1是重要的抗凋亡蛋白,也是NF-κB调控的靶基因。靶向A1的siRNA具有促进HSC细胞凋亡作用。本研究结果表明NF-κB siRNA转染HSC-T6 72h时Bcl-2蛋白表达(0.31±0.14 vs. 0.71±0.06)和A1 mRNA表达水平(0.60±0.06 vs. 0.9±0.10, P<0.05)较scramble siRNA组显著降低。④NF-κB siRNA转染对HSC-T6细胞ECM的作用:NF-κB siRNA转染HSC-T6 72h后,MMP-2活性明显高于scramble siRNA组,而Ⅰ型前胶原、TIMP-1、α-SMA和TGFβ1mRNA表达量较scramble siRNA组明显减少(P <0.05),表明NF-κB siRNA有助于减少ECM合成,加强降解,从而的利于肝纤维化的逆转。结论: NF-κB介导的siRNA下调靶基因NF-κB的表达,诱导HSCs细胞凋亡诱导,激活MMP-2活性,减少I型前胶原、α-SMA、TGFβ1和TIMP-2表达,有利于抗肝纤维化,其机制可能与下调抗凋亡蛋白Bcl-2和A1表达有关。第二部分:双环醇对HSC-T6细胞凋亡、凋亡机制和ECM代谢的影响目的:探讨双环醇对HSC-T6细胞增殖、凋亡作用的影响;双环醇对NF-κB活性的抑制作用;双环醇对Caspase3、线粒体膜电位的影响;双环醇对HSC-T6细胞ECM代谢的影响,为双环醇治疗肝纤维化提供理论依据。方法:体外培养HSC-T6,观察H2O2不同时间对NF-κB活化作用,然后给予双环醇处理,观察双环醇对H2O2诱导的NF-κB活化的抑制作用;观察不同时间、不同剂量双环醇对HSC-T6凋亡的影响及机制,实时荧光定量PCR法检测转染细胞中NF-κB p65、I型前胶原、TIMP-1、α-SMA、TGFβ1和抗凋亡蛋白A1 mRNA表达, Western blot检测NF-κB p65表达;Hoechst3325染色后荧光显微镜检测HSC-T6细胞凋亡;激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测双环醇对线粒体膜电位的影响。结果:①双环醇对HSC-T6细胞凋亡的影响:Hoechst3325染色后荧光显微镜检测显示,双环醇具有促进HSC-T6凋亡作用,凋亡细胞表现为细胞核浓缩、凋亡小体形成,且随着浓度的加大和时间的延长细胞凋亡率明显增加,0.5mM双环醇组凋亡率最高(27.157±1.936)%,24、36h凋亡最为明显。Ac-DEVD-CHO是一种Caspase 3抑制剂,可以抑制由Caspase 3激活导致的细胞凋亡,是最常用的细胞凋亡抑制剂之一,常用于观察特定的细胞凋亡是否通过Caspase 3激活来介导。本研究结果表明Ac-DEVD-CHO可部分反转双环醇诱导的HSC-T6细胞凋亡(P<0.05),提示双环醇促进HSC-T6细胞凋亡至少部分作用是通过活化caspase 3实现的。②双环醇对HSC-T6细胞增殖作用的影响:实验显示体外培养的HSC-T6在加入双环醇后3H-Tdr掺入的DPM值显著下降,并随着浓度的加大,下降趋势更加明显,0.5mM的双环醇抑制作用最强,说明双环醇对体外培养的肝星状细胞增殖有明显抑制作用。③双环醇对H2O2诱导的NF-κB P65表达的影响:H2O2由粒细胞和吞噬细胞中超氧离子产生,是重要的氧自由基。H2O2大量产生,使细胞处于氧化应激状态,并参与多条细胞内或细胞间的信号转导途径,介导多种生理和病理反应。ROS可以激活内皮细胞膜上的磷脂酶C,促使胞内Ca2+上升,激活钙调磷酸酶或丝裂原活化蛋白激酶,最终导致NFκB活化。本研究显示H2O2与HSC-T6细胞一起培养可提高NF-κB P65表达水平,双环醇组NF-κB P65蛋白表达较对照组均降低,且随作用浓度增加,抑制作用增强,0.3mM组、0.5mM组蛋白表达量分别为1.41±0.06,0.70±0.12,与对照组2.35±0.19比较,表达量降低;1.0mM组蛋白表达量0.68±0.15与对照组2.35±0.19比较,表达量降低。双环醇对H2O2诱导的NF-κB P65蛋白表达的抑制作用具有时间依赖性,与对照组相比,双环醇干预组NF-κB P65表达随着时间的延长逐渐下降,于60min时表达最低,30min、60min、90min蛋白表达量分别为1.53±0.11,0.79±0.15,0.77±0.19与对照组2.33±0.24比较,P<0.05,有统计学差异,上述结果表明H2O2可诱导HSC-T6细胞NF-κB表达增加,双环醇对此有抑制作用,并有时间和剂量依赖。④双环醇对NF-κB活性的抑制作用:静止状态的细胞中,NF-κB与IκB结合以非活性的形式稳定存在细胞质中,当细胞受到细胞因子(TNF-α、IL-1、IL-17、IL-18)、LPS、病毒及其代谢物、氧化剂、紫外线照射等外界因素刺激时,IκB被蛋白激酶磷酸化,蛋白酶小体降解,使NF-κB迅速从细胞质转位到细胞核,与相关基因的κB位点发生特异性结合,引起相应基因的转录。免疫荧光抗体-抗小鼠Cy3染色,激光扫描共聚焦显微镜观察,追踪NF-κB核位移变化,可以灵敏反应NF-κB活化情况。本研究表明NF-κB静息状态下主要位于HSC-T6细胞胞质,少量位于细胞核,TNF-α与HSC-T6共同培养1h后,NF-κB迅速发生核转位,细胞核内P65明显增多;双环醇作用1h后,再加TNF-α,则抑制了NF-κB P65核位移,主要位于细胞质,少量位于细胞核,提示双环醇抑制TNF-α介导活化的HSC-T6 NF-κB活化。⑤双环醇对线粒体膜电位的影响:无论是激光共聚焦扫描显微镜检测,还是染色流式细胞仪检测,两者结果均一致表明,双环醇可以降低活化的肝星状细胞的线粒体膜电位,作用在8h、16h作用最强,0.5mM双环醇8h干预组、16h干预组绿色荧光强度明显高于阴性对照组,而与阳性对照组相似;0.5mM双环醇24h干预组绿色荧光强度明显降低。单因素方差分析P<0.05,各组线粒体膜电位总体均数组间差异有统计学意义,8h组(1.068±0.288)、16h组(1.005±0.214)与阳性对照组(1.217±0.054)膜电位无差别,均低于阴性对照组(1.728±0.380),24h组膜电位与阴性对照组无差别。⑥双环醇对HSC-T6细胞Caspase3活性的影响:数据表明双环醇处理后,HSC-T6细胞Caspase3明显增加,与对照组相比具有显著统计学意义,P<0.05,各组Caspase3活性总体均数差异有统计学意义。双环醇0.5mM组(2.327±0.179) Caspase3的活性最高,Caspase3抑制剂Ac-EDVE-CHO能减低双环醇引起的Caspase3升高,说明双环醇可增高Caspase3的活性。⑦双环醇对HSC-T6细胞ECM的影响:双环醇处理后Ⅰ型前胶原、TIMP-1、α-SMA和TGF-β1 mRNA表达量较对照组明显减少(P <0.05),表明双环醇有助于减少ECM合成,加强降解,从而有利于肝纤维化的逆转。⑧双环醇对抗凋亡蛋白A1、GADD45βmRNA表达的影响:双环醇处理后抗凋亡蛋白A1、GADD45βmRNA表达水平较对照组显著减少,表明双环醇抑制抗凋亡蛋白A1、GADD45βmRNA表达。结论:双环醇可诱导HSC-T6细胞凋亡;抑制H2O2诱导的NF-κB活化;促进HSC-T6 Caspase3活性、降低线粒体膜电位;减少Ⅰ型前胶原、TIMP-1、α-SMA和TGF-β1 mRNA表达,其机制可能与抑制抗凋亡蛋白的转录有关。第三部分双环醇对CCl4诱导小鼠急性肝损伤的保护作用目的:研究双环醇对CCL4致小鼠急性肝损伤的保护作用;对NF-κB及其调控炎症因子抑制作用;对HSC活化的影响。方法: 60只雄性昆明小鼠(28±2.2) g,随机分为6组,即正常对照组、肝损伤组、NF-κB抑制剂组、双环醇低剂量组(0.5 mg/ml/10g)、双环醇中剂量组(1 mg/ml /10g)、双环醇高剂量组(5 mg/ml/10g)。实验第一天,第二天双环醇各组动物均灌服相应药物0.04 ml/10g/d。对照组和肝损伤组均灌服生理盐水0.04 ml/10g。第三天除对照组外,各组均腹腔注射0.1% CCL4 0.1ml/10g,对照组腹腔注射生理盐水0.1ml/10g,注射后两小时,双环醇各组继续灌服相应药物0.04ml/10g/d,对照组和肝损伤组灌服生理盐水0.04ml/10g,第五天,灌胃后两小时,所有动物处死,分离血清-20℃保存以备测ALT、AST,取肝右叶-70℃保存以备测MDA、SOD,取部分肝左叶于冰上速切成约1mm3的小块,4%戊二醛4℃固定,以备透射电镜观察。取部分肝左叶10%甲醛固定,用于HE染色和ICAM-1、COX-2、α-SMA及NF-κB免疫组组织化学染色。结果:①急性肝损伤组血清ALT、AST及MDA较正常组显著升高,SOD降低明显。双环醇各治疗组、抑制剂组血清ALT、AST及MDA较肝损伤组降低,SOD升高,随着双环醇浓度的增加,作用更加明显;②免疫组织化学染色示在正常组织中ICAM-1、COX-2、NF-κB表达较少,α-SMA表达于血管平滑肌细胞中。肝损伤组ICAM-1在肝坏死区表达,COX-2阳性细胞分布在汇管区周围,α-SMA广泛表达于肝窦壁,NF-κB表达广泛分布在细胞核中,双环醇明显下调NF-κB及其调控的炎症因子ICAM-1、COX-2、α-SMA的表达。结论:双环醇可以清除氧自由基;NF-κB及其调控的炎症因子的表达,减轻肝损伤,减少α-SMA表达,有利于防治肝纤维化。