论文部分内容阅读
粘细菌是变形菌纲下δ分支的一类单细胞革兰阴性细菌,营养细胞杆状,具有复杂的多细胞行为,可以滑行运动,在营养贫瘠的条件下,细胞开始聚集形成多细胞团,并逐渐形成含抗逆性强的粘孢子的子实体。粘细菌广泛分布于富含腐殖质的土壤表层、腐败的树木枯枝落叶、草食类动物的粪便等环境中,其次级代谢产物结构各异、种类多样、活性高效。粘细菌已经被认为是“活性微生物天然产物小工厂”,是筛选天然产物的重要资源,具有药物先导分子的研究开发价值。本文采用灭活大肠杆菌和滤纸片诱导子实体法,从我国广东、山东、及江西、湖南、湖北、山西等省市采集的32份土壤样品中进行粘细菌的分离筛选,对分离的粘细菌进行子实体和菌落形态观察、生理生化特征检测及分子生物学鉴定,以确定这些菌株的分类地位。本次研究共分离纯化出40株细菌。根据粘细菌菌落、子实体、营养细胞及粘孢子等形态学观察结果,初步鉴定这些粘细菌菌株分属于粘细菌的4个属,分别为:粘球菌属10株;珊瑚球菌属9株;侏囊菌属11株和纤维堆囊菌属10株。采用灭活大肠杆菌和滤纸片诱导子实体法纯化得到8株粘细菌,并对这8株粘细菌进行了深层鉴定与后续研究。经16S rDNA序列同源性分析可知,分离的8株粘细菌菌株与已知菌株Nannocystis pusilla strain DSM71、Corallococcus exiguus strain DSM 14696、Corallococcus macrospores strain STXZ 54、Myxococcus sp.strain DSM 2260、Phaselicystis flava strain SBKo001、Myxococcus fulvus strain NBRC100070、Myxococcus xanthus strain DK 1622、Sorangium cellulosum strain KYC3080具最高相似性,相似性分别为99%、99%、100%、99%、92%、99%、99%、99%。根据 16SrDNA 序列构建了系统发育树,阐明8株粘细菌种属间的亲缘关系,将这8株菌分别鉴定并命名为 S8(N.pusilla STXZ8),S20(C.exiguus STXZ20),S22(C.macrosporus STXZ22),S34(M.sp.STXZ34),S47(P.flava STXZ47),S51(M.fulvus STXZ51),S55(M.xanthus STXZ55),S68(ScellulosumSTXZ68)。通过平板扩散法、昆虫口服毒性测试、肿瘤细胞毒性测试等方法检测各菌株代谢产物的抑菌、抗肿瘤及杀虫生物活性。8株粘细菌的生物活性实验分析结果显示,分离株S22表现了对革兰阳性菌枯草芽孢杆菌和致病菌白色念珠菌具有一定的生长抑制作用;6株分离菌S20、S22、S34、S47、S51、S55对小鼠黑色素肿瘤细胞(B16)、小鼠乳腺癌细胞(4T1)、人类宫颈癌细胞(HeLa)、人类结肠癌细胞(HCT-116)、人类肝癌细胞(Hep-3B)等多种肿瘤细胞和人正常细胞脐静脉上皮细胞(HUVEC)显示了不同程度的细胞增殖抑制作用;杀虫生测实验显示菌株S51对棉铃虫幼虫和甜菜夜蛾幼虫均具有一定的口服杀虫活性。随后根据粘细菌活性实验检测结果,我们选定了抑菌活性及抗肿瘤活性最强的菌株为大孢珊瑚球菌Cmacrosporu.S22,采用MD1液体培养基,在发酵温度为30℃,转速为160rpm的条件下,对菌株S22进行大批量液体摇瓶发酵培养,离心去除菌体后,取上清液经硫酸铵沉淀除蛋白、XAD-16树脂吸附、反相柱层析等物质分离纯化手段,对发酵上清液进行分离纯化,得到1个较纯的单峰物质组分SAMe1,体外肿瘤细胞实验结果显示该组分SAMe1具较强的抗肿瘤活性,具有重要的开发价值。本研究工作发现的具有抗菌和抗肿瘤活性的粘细菌新菌株不仅丰富了微生物药用菌种资源库,对菌株S22抗肿瘤细胞活性物质的分离工作也为药物先导分子的的研发及应用奠定了重要基础。