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肟菌酯（Trifloxystrobin）是甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的代表性的品种之一,主要用于防治作物、蔬菜和水果等农产品的真菌病害。因其在全球的使用非常广泛,从土壤、水体和农产品中都检测到肟菌酯残留,对生态环境和人类健康造成了潜在威胁。研究表明微生物在肟菌酯降解过程中发挥重要作用。目前虽然已经报道了几株肟菌酯降解菌,但是还没有关于肟菌酯降解酶和基因的报道。因此,肟菌酯的微生物降解分子机制还未被阐明。本研究从肟菌酯降解菌的分离筛选出发,从代谢途径,基因及酶学水平上解析肟菌酯的微生物代谢机制,得到了以下研究结果。1、肟菌酯降解菌的分离鉴定及其生长和降解特性研究通过细菌富集培养的方法,从长年产肟菌酯的农药厂的污泥里分离得到了 1株肟菌酯降解菌。通过细菌的形态学、生理生化特性和16S rRNA基因系统发育分析将菌株初步鉴定为Hyphomicrobiumsp.,命名为Hyphomicrobium sp.DY-1。菌株 DY-1 最适生长温度和pH分别为35℃、pH 7.0。在一定程度上,菌株DY-1随着通气量的增加生长状况越好。菌株DY-1可以利用甲醇、乙醇和淀粉作为碳源生长,其中甲醇为最适碳源。菌株DY-1可以利用酵母粉、蛋白胨、氯化铵、硝酸钾、和牛肉膏作为氮源生长,酵母粉为其最适氮源。菌株DY-1降解肟菌酯最适温度和pH分别为35℃、pH 8.0,通气量和接种量的增加有利于其对肟菌酯的降解。在35℃和pH 8.0的条件下,菌株DY-1在60 h内能够完全降解0.4 mM的肟菌酯。菌株DY-1还可以降解同为甲氧基丙烯酸酯类的农药啶氧菌酯和嘧菌酯,其降解速率为肟菌酯＞啶氧菌酯＞嘧菌酯。通过HPLC-MS/MS鉴定了菌株DY-1降解肟菌酯的降解产物并推测其代谢途径,发现其可以将肟菌酯完全水解为肟菌酸和甲醇。2、肟菌酯水解酶triH基因的克隆与功能鉴定利用菌株DY-1可以在含有0.24mM肟菌酯的LB平板上产生透明水解圈的特性,采用鸟枪法建库的方法,从15,000株转化子中获得1株阳性克隆子;通过HPLC/MS-MS分析表明,该阳性克隆子可以将肟菌酯转化为肟菌酸。通过测序从该阳性克隆子中得到一个水解酶基因triH,该基因全长1,713 bp,编码570个氨基酸,对TriH的氨基酸序列分析显示该酶属于α/β水解酶超家族,与该酶氨基酸序列相似性最高的酶是来自于Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168 的 Para-nitrobenzyl esterase（P37967）（相似性为34%）,在氨基酸序列系统发育进化树中,TriH与细菌酯酶第Ⅶ家族在一簇上,且TriH符合第Ⅶ家族的特征,表明TriH属于细菌酯酶第Ⅶ家族的新成员。3、肟菌酯水解酶TriH的酶学特性研究在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）中表达triH基因并用Strep-Tactin琼脂糖凝胶FF纯化得到TriH。对TriH水解肟菌酯产物的鉴定表明它能够断裂肟菌酯中的酯键,将肟菌酯水解为肟菌酸。TriH水解肟菌酯的最适温度为50℃,pH为7.0;它的活性不受EDTA的影响,表明TriH不是金属依赖的酯酶,但其活性受到金属离子不同层度的影响。其中,TriH的活性不受Mg2+,Ni2+及Hg2+浓度的影响;随着Cu2+浓度的增加酯酶TriH的活性而增加;低浓度的Ca2+、Fe2+、Fe3+及Mn2+对TriH的酶活有少量的促进作用;高浓度的Fe3+有抑制作用;而高浓度的Co2+及Zn2+对TriH的酶活有少量促进作用。氨基酸序列比对发现TriH中存在酯酶保守序列GXSXG及催化活性位点Ser-Glu-His。分别将TriH中推测的保守催化位点Ser232、Glu354和His467通过重叠延伸PCR的方法分别突变为丙氨酸（Ala）。并测定纯化后突变体对肟菌酯的水解活性,结果显示三个突变体都失去了对肟菌酯的水解功能,该结果证明了 Ser232、Glu354和His467三联体为肟菌酯水解酶TriH保守的催化位点。对TriH进行了动力学参数分析,TriH对肟菌酯、啶氧菌酯、嘧菌酯的Km值分别为 4.47±0.47、12.35±0.70 和 30.26±4.85 μM,kcat值分别为 877.55±10.31、57.32±0.64 和 0.73±0.06 s-1,其催化效率kcat/Km分别为 196.32、4.64 和 2.41 × 10-2 μM-1 s-1;该结果表明,在这三种甲氧基丙烯酸酯类杀虫剂中TriH对肟菌酯的亲和力最好,且催化效率最高。肟菌酯及其被TriH水解的产物肟菌酸对小球藻（Chlorella.ellipsoidea）毒性试验表明,肟菌酯对小球藻（C.ellipsoidea）的生长有明显的抑制作用,而TriH降解肟菌酯的终产物肟菌酸对小球藻（C.ellipsoidea）的生长无明显的影响。结果表明TriH可以将肟菌酯水解为肟菌酸而解除其对小球藻（C.ellipsoidea）生长的抑制,从而实现对肟菌酯的脱毒功能。