环糊精葡萄糖基转移酶(简称CGT酶,EC 2.4.1.19)是一种能够通过分子内转糖基化反应转化淀粉及相关基质合成环糊精的胞外酶。随着环糊精在食品、医药等领域的应用越来越广,CGT酶已经成为当今研究的热点。为了克服天然菌株的低CGT酶生产能力,CGT酶基因在大肠杆菌(Escherichia coli)中过量表达被认为是最有效途径之一。然而,以前的报道表明,CGT酶在E. coli中表达通常形成不溶性包涵体或定位于周质空间,限制了其工业应用,因此,实现CGT酶的胞外表达是迫切需要的。本论文以实验室构建的含表达载体cgt/pET20b(+)的E. coli BL21(DE3)为生产菌株,以实现重组α-CGT酶的高产量及高生产强度为目标,对在发酵培养基中添加适量添加剂对胞外基质中的产酶情况进行了较为系统的研究,并进一步对其机理进行了剖析。主要研究结果如下:(1)在摇瓶发酵培养中,考察了表面活性剂的添加对重组E. coli胞外生产α-CGT酶的影响。研究结果表明,在发酵培养基中添加表面活性剂对重组E. coli的生长都有一定的抑制,而且添加浓度越大,抑制作用越强。其中CTAB对菌体生长的抑制作用最大; Tween-80对菌体生长的抑制作用最小。表面活性剂的添加对重组E. coli胞外生产α-CGT酶有促进作用,其中在发酵20 h添加0.02% SDS效果最好,发酵40 h胞外α-CGT酶酶活达5.31 U/mL,比对照组提高了5.25倍。(2)在摇瓶发酵培养中,考察了金属离子的添加对重组E. coli胞外生产α-CGT酶的影响。研究结果表明,只有在发酵培养基中添加Ca2+才对重组E. coli胞外生产α-CGT酶有促进作用,当其添加浓度为2.5 mM时,胞外α-CGT酶酶活达1.12 U/mL,是对照组的1.3倍。Ca2+对胞外酶活的提高除了与细胞膜透性有关,还可能与其对细胞生长的轻微促进作用有一定的关系。(3)在摇瓶发酵培养中,考察渗透压调节剂的添加对重组E. coli胞外生产α-CGT酶的影响。研究结果表明,蔗糖和山梨醇对菌体的生长有较好的促进作用,其他添加剂对菌体的生长都有不同程度的抑制作用。而只有添加L-脯氨酸和钠离子对胞外生产α-CGT酶有促进作用,当脯氨酸和钠离子的添加浓度分别为75 mM和500 mM时,胞外酶活分别是对照组的2.02倍和4.2倍。(4)以SDS、Na+、甘氨酸和Ca2+为四个因素,以实现α-CGT的高产量为目标设计L9(34)正交实验,正交优化实验结果表明,影响产酶的各种因素的主次因子顺序为甘氨酸> SDS > Na+ > Ca2+。大肠杆菌胞外生产α-CGT酶的最佳工艺条件为添加0.03% SDS, 400 mM Na+,0.3%甘氨酸和10 mM Ca2+。发酵条件优化后得到的酶产量比优化前的酶产量提高了15倍左右,达到12.89 U/mL。(5)分别以ONPG和NPN荧光探针观察重组E.coli细胞内膜和外膜渗透性的变化,结果显示,在发酵最佳工艺条件下培养的重组E.coli细胞内外膜相对于对照组有更高的的渗透性,使得重组α-CGT酶更容易释放到胞外。(6)对重组E.coli细胞膜磷脂含量的分析表明:在发酵最优工艺条件下培养的重组E.coli细胞膜中磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰乙醇胺(PE)含量分别为20.3%和71%,而在不含任何添加剂的培养基中培养的重组E.coli细胞膜中PG和PE含量分别18.2%和75.8%。PG含量的增加,可能促进了分泌伴侣蛋白SecA与膜的结合,同时促进了前体目标蛋白的跨膜运出,从而提高了胞外重组α-CGT酶的产量。(7)对重组E.coli细胞膜磷脂含量的分析表明:在发酵最优工艺条件下培养的重组E.coli,其细胞膜中C16:1、C18:1和C19:1酸的百分含量都有所提高,分别从对照的1.3 %、13.41 %和2.28 %提高到2.34 %、20.85 %和23.27 %,C14:1酸的百分含量从对照的0.29 %降低到0.11 %。培养基添加剂的添加还促使膜脂中C17:0酸的百分含量从27.45 %降低到26.11 %。培养基添加剂可能通过改变了细胞膜脂中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸之间的比例,因而提高细胞膜的流动性,使得重组α-CGT酶更容易释放到胞外。