铜绿假单胞菌( Pseudomonas aeruginosa, Pae)是院内感染的主要病原菌之一。在中国重症监护病房分离的革兰阴性菌中,铜绿假单胞菌位列第一。由于具有天然和获得性耐药,铜绿假单胞菌对很多抗菌药物耐药,给临床治疗带来很大困难。β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类抗菌药物是临床治疗Pae感染的常用药,近年来随着新的耐药基因的不断出现,Pae对这三类抗菌药物的耐药性普遍增加,甚至出现多药耐药(MDR)和泛耐药(PDR)菌株。因氨基糖苷类抗生素抗菌谱广、疗效卓越,在医学临床和畜牧兽医业应用广泛,但由于滥用和过度使用氨基糖苷类药物的耐药问题随之凸现,细菌对该类药物耐药是因为细菌产生氨基糖苷类修饰酶(AMEs)、16SrRNA甲基化酶和氨基糖苷类抗生素作用靶位16S rRNA基因突变而致。氨基糖苷类修饰酶按功能可分成乙酰转移酶(AAC)、磷酸转移酶(APH)、核苷转移酶(ANT)三类,分别修饰氨基糖苷药物相应位置上的- OH和- NH2 ,降低或丧失其对靶位核糖体的亲和力。编码AMEs的基因起源于抗生素产生菌,该类基因所表达的酶在抗生素产生菌中起到自我保护作用,许多研究表明抗药性产生菌所存在的自我保护机制与临床耐药菌的耐药机制相同。整合子是一个能够通过自身编码的整合酶来获取保外游离基因或基因片段并使之表达的遗传元件系统。整合子既可位于细菌染色体上,又可位于质粒上,还可位于转座子上。对细菌抗生素耐药机制的研究,导致了包括转座子和共轭质粒在内的许多移动元件的发现,而通过对这些元件序列进行比较分析后,最终发现了整合子的存在。研究目的铜绿假单胞菌是院内感染的主要条件致病菌之一,可引起严重的院内获得性感染。本研究试图了解临床常用的七种抗生素对60株铜绿假单胞菌(30株分离自门诊病人,30株分离自住院病人)的抗菌活性和多黏菌素B与其它六种抗菌药物(庆大霉素、奈替米星、阿米卡星、妥布霉素、环丙沙星、亚胺培南)体外联合抗菌效应,以及各种抗菌药物对不同标本来源菌株的抗菌效应有无差别;了解氨基糖苷类耐药相关基因和16SrRNA甲基化酶基因存在情况以及菌株之间的亲缘性;另外通过对临床分离的铜绿假单胞菌的耐药特征进行分析、检测相关耐药基因和整合子携带情况等,初步探讨铜绿假单胞菌对临床常用抗菌药物的分子耐药机制,从而了解不同的耐药机制间相互作用规律以及耐药基因在菌株间水平传播的特点,为临床用药提供实验室依据和帮助。研究方法1、药敏试验和联合药敏试验60株铜绿假单胞菌均来自广州医学院第一附属医院的临床标本,对这些菌株采用琼脂稀释法测定7种临床常用抗生素的最低抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC)和药敏情况,分析铜绿假单胞菌对这些抗生素的药物敏感性;同时检测多粘菌素B与其它6种药物的联合药敏情况,分析它们之间的联合药敏情况,试图开辟治疗Pae感染新的途径,在用药选择、降低用药量和毒副作用方面起到一定作用。2、多药耐药铜绿假单胞菌氨基糖苷类修饰酶和16SrRNA甲基化酶基因分析针对临床分离的Pae菌株,采用聚合酶链反应分析氨基糖苷类修饰酶、16SrRNA甲基化酶基因型及其它基因型,运用SPSS统计分析软件对菌株样本亲缘性做聚类分析。3、整合子的鉴定与分析利用PCR方法,通过扩增整合子恒定区的方法,筛选携带整合子的菌株,并利用限制性片段多态性性(RFLP)酶切分析的方法对这些整合子进行分类;对整合子恒定区扩增阳性的菌株进行测序和序列分析。探讨整合子携带的耐药基因盒是否介导铜绿假单胞菌的多重耐药。研究结果1、铜绿假单胞菌对三类六种抗生素耐药率普遍较高,分别为奈替米星68.3%、妥布霉素65.0%、庆大霉素60.0%、环丙沙星46.7%、亚氨培南40.0%、阿米卡星13.3%,而多黏菌素B的耐药率为0;这些菌株中多重耐药和泛耐药菌的检出率分别为55.0%(33/60)和31.7%(19/60)。多黏菌素B与环丙沙星、亚氨培南有明显联合抗菌效应,多黏菌素B与奈替米星联合,能明显降低彼此的MICG。各种抗生素对住院病例分离菌株和门诊病例分离菌株,在MICG和差异显著性方面表现各不相同。2、21株氨基糖苷类耐药菌株中(其中20株为多药耐药菌株),氨基糖苷类耐药基因型aac(6,)-Ⅰ阳性13株(61.9%)、aac(6,)-Ⅱ阳性13株(61.9%)、ant(2,,)-Ⅰ阳性10株(47.6%)、ant(3,,)-Ⅰ阳性9株(42.9%)、aac(3)-Ⅱ阳性的有1株(4.8%),另有1株菌oprD2基因缺失,未检出基因型aac(6,)-Ⅰae、aph(3,)-Ⅲ、aac(6,)-aph(2,,)和ant(4,)-Ⅰ;16SrRNA甲基化酶基因rmtA基因型阳性19株(90.4%)、armA基因型阳性有8株(38.1%),未检出基因型rmtC、rmtD。聚类分析结果显示分离的菌株中存在克隆传播。3、30株临床分离铜绿假单胞菌中16株(53.3%)整合子恒定区和可变区扩增阳性,片段长度在0.7-4kb之间。共检出5种不同的整合子组合形式,含有编码对氨基糖苷类、β-内酰胺类和喹喏酮类抗菌药耐药的基因,其中有2例为新型基因盒组合形式,包括aacA4-VIM2和aadA2-OXA10-aacA4-blaIMP9-aatI1,Genbank基因库登陆号分别为GQ890658和GU122165,另外3例分别与Genbank基因库登录号为FJ917747、FJ817423、GU367339的序列吻合。4、I类整合子3′-末端qacEΔ1-sul1和intI1类整合酶基因的阳性率和阳性菌株相同。结论1、临床检出的铜绿假单胞菌对常用抗生素多表现为多重耐药。多黏菌素B单用有很好的抗铜绿假单胞菌效果,与环丙沙星(喹诺酮类)、亚氨培南(β-内酰胺类)联合应用也有明显的联合抗菌效应。对多药耐药和泛耐药菌株,为减少用药量和毒副作用,提高抗菌效果,可考虑多黏菌素B与这些抗生素联合用药。2、大部分测试的铜绿假单胞菌对临床常用的铜绿假单胞菌抗感染药物已产生广泛耐药,尤其对氨基糖苷类抗生素。这些菌株的氨基糖苷类修饰酶常见耐药基因型检出率高, 16SrRNA甲基化酶基因型rmtA和armA的检出率亦较高。30株测试菌株中存在克隆传播。3、本研究中携带intI1类整合子的16株Pae对氨基糖苷类全部耐药,对喹喏酮类耐药的有13株,对亚氨培南耐药的有10株,对所有三类抗生素全部耐药的有8株占50%,说明目前引起Pae耐药的机制中,整合子耐药机制越来越起着重要的作用。铜绿假单胞菌的耐药和多重耐药与整合子密切相关,主要携带氨基糖苷类和β内酰胺类抗生素耐药基因,首次发现2种携带新型基因盒组合形式的整合子。4、I类整合子3′-末端qacEΔ1-sul1和intI1类整合酶基因的阳性率和阳性菌株相同,表明这2个基因是紧密伴随intI1而存在的,可作为I类整合子的标志基因。