家蚕是鳞翅目模式生物,其天然有色茧是具有重大应用前景的遗传资源。目前,国内外家蚕有色茧分子遗传研究和应用还刚刚起步,由于家蚕茧色受多基因调控,遗传机制了解不详,挖掘和研究茧色调控基因是被公认的有效突破口之一。家蚕Ys品种是本研究室选育和保存的限性黄茧品种,其雌为黄茧,雄为白茧,为研究黄、白茧之间差异表达基因提供了非常好的材料。本文以家蚕限性黄茧Ys品种为材料,用抑制性消减杂交技术(SSH)构建了Ys品种雌特异表达基因的cDNA文库,结合RACE-PCR技术和生物信息学方法对雌雄差异表达的类胰凝乳蛋白酶基因(Chymotrypsin-like proteinase gene, Ctlp gene)进行了克隆鉴定、蛋白质结构和分子进化分析,用RT-PCR和Real-Time PCR等技术调查了5龄3天不同组织中Ctlp基因的表达谱,并进行了原核表达初步研究。获得的主要结果如下:1家蚕限性黄茧Ys品种雌特异表达基因的cDNA文库在SSH方法构建的家蚕限性黄茧Ys品种雌特异表达基因的cDNA文库中,随机挑选克隆测序得到94个EST,其中9个为有确定注释的EST序列,5个EST序列是未知的。有注释的EST序列分别为NAPDH氧化还原酶、真核起始因子5A,热休克同源蛋白、丝氨酸蛋白酶前体、包含绒毛膜基因序列基因、β-微管蛋白和3个核糖体RNA和蛋白基因。WEGO分析结果表明这些注释基因主要分为细胞组成、分子功能和生物进程三部分,参与了能量代谢、细胞组成、结合活性和催化活性等各种复杂的生命活动。2克隆鉴定了家蚕类胰凝乳蛋白酶基因Ctlp选择在家蚕雌性消化管特异高水平表达的EST进行了基因挖掘与克隆,克隆基因的全长cDNA序列976 bp,最长ORF为840 bp,编码279个氨基酸。蛋白序列分析表明,该基因编码的蛋白质属于分泌蛋白,蛋白分子量为29 780.10(或29 781.00),等电点8.75(或9.07),在其氨基酸残基1-20和50-100两个区域有由内到外的跨膜螺旋,该蛋白的螺旋约占17.56%,延伸链约占27.60%,β转角约占8.60%,随机卷曲结构约占46.24%。含有1个N-糖基化位点、2个蛋白激酶C磷酸化位点、11个N-十四酰基位点、1个胰蛋白酶家族中丝氨酸蛋白酶的组氨酸活性位点、1个胰蛋白酶家族丝氨酸蛋白酶的丝氨酸活性位点、1个氨甲酰磷酸盐合成酶亚基标签2。蛋白功能域(保守区)分析结果表明,该基因编码蛋白质的38-274位氨基酸属于胰蛋白酶类似的丝氨酸蛋白酶结构域,分子进化分析表明,该蛋白属于昆虫的胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin),与烟芽夜蛾(Heliothis virescens, H.virescens)、甜菜夜蛾(Spodopera exigua, S.exigua)和棉铃虫(Heliothis armigera, H.armigera)等鳞翅目昆虫的亲缘关系最近,与脊椎动物的进化关系较远,符合传统意义上的进化关系。因此命名该基因为类胰凝乳蛋白酶基因(Chymotrypsin-like proteinase gene, Ctlp gene)。3家蚕Ctlp基因的表达谱结果家蚕EST表达谱分析结果表明,Ctlp基因只在家蚕幼虫期的中肠特异表达。芯片表达谱分析结果显示,Ctlp基因在大造雌雄共18个组织(器官)中的表达水平有显著差异,特异性的几乎只在中肠表达。RT-PCR组织表达谱和Real-Time PCR定量分析结果表明,Ctlp基因在家蚕Ys品种5L-3d幼虫的中肠和生殖腺中均有表达,而在丝腺、脂肪体中几乎不表达,在雌性个体的中肠表达量最高,显著高于雄性个体,生殖腺中有低表达。4家蚕Ctlp基因原核表达结果用E. coli Rosetta 2(DE3)菌株进行原核表达,SDS-PAGE和Western Blot结果可以看到表达产物,但是条带比较不明显,还没有形成包涵体,仍需进一步优化改善表达条件。