研究目的： 1.研究白藜芦醇对小鼠腹腔巨噬泡沫细胞胆固醇外流的影响。 2.探讨白藜芦醇促进泡沫细胞胆固醇外流的可能机制。 研究方法： 1.小鼠腹腔巨噬细胞的分离、体外培养与巨噬泡沫细胞模型的建立与鉴定将小鼠(20g～25g)脱颈椎处死，消毒后置于实验台上，剥离腹部皮肤。将PBS注入腹腔，轻揉腹部后用无菌的吸管吸取腹腔内PBS液，收集于塑料离心管中，室温下以3，000rpm离心10min。离心后所得细胞重悬于RPMI-1640培养基中，调节细胞浓度达2×106个/ml。用台盼蓝染色法观察细胞存活率，要超过95％。将细胞接种于12孔板，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育3h后沈去未贴壁细胞，重新于每孔中加入RPMI-1640培养基(含10％FBS)。 用密度梯度离心法分离血浆低密度脂蛋白(LDL)，用硫酸铜氧化修饰成为氧化LDL(ox—LDL)。在细胞培养基中加入ox—LDL，使其每孔终浓度为50μg/ml，细胞置于CO2培养箱中孵育24h，使细胞转变为巨噬泡沫细胞。 用荧光酶学法检测巨噬泡沫细胞内胆固醇的含量，用BCA蛋白定量试剂盒检测细胞内蛋白含量以鉴定巨噬泡沫细胞模型是否成立。 2.白藜芦醇对巨噬泡沫细胞胆固醇外流的影响10μM、50μM和100μM白藜芦醇分别培养巨噬泡沫细胞24h，用MTT法评价白藜芦醇对巨噬泡沫细胞的增殖毒性。 用10μM、50μM和100μM白藜芦醇分别培养巨噬泡沫细胞24h。荧光酶学法检测细胞和培养基中的总胆固醇和游离胆固醇的含量。 用10μM、50μM和100μM白藜芦醇分别培养巨噬泡沫细胞0h、12h、24h和36h，再与10μg/mLapoAI孵育24h。荧光酶学法检测细胞和培养基中的总胆固醇和游离胆固醇的含量。 3.白藜芦醇对巨噬泡沫细胞ABCA1和ABCG1表达的影响用10μM、50μM和100μM白藜芦醇分别培养巨噬泡沫细胞24h，提取细胞总RNA，采用荧光定量PCR的方法检测ABCA1和ABCG1mRNA的表达。 4.放线菌素D对白藜芦醇诱导ABCA1和ABCG1表达的影响将防线菌素D(5μg/mL)与100μM白藜芦醇共同培养巨噬泡沫细胞24h，采用荧光定量PCR的方法检测ABCA1和ABCG1mRNA的表达。 5.放线菌素D和ABCA1抑制剂对白藜芦醇诱导胆固醇外流的影响将放线菌素D(5μg/mL)或DIDS(400μM)分别与100μM白藜芦醇共同培养巨噬泡沫细胞24h，再与10μg/mLapoAI孵育24h，荧光酶学法检测细胞和培养基中总胆固醇和游离胆固醇的含量。 6.白藜芦醇对巨噬泡沫细胞LXRα表达的影响用10μM、50μM和100μM白藜芦醇分别培养巨噬泡沫细胞24h，提取细胞总RNA，采用荧光定量PCR的方法检测LXRαmRNA的表达。 7.LXRα抑制剂(GGPP)对白藜芦醇诱导ABCA1和ABCG1表达和胆固醇外流的影响用10μMGGPP与100μM白藜芦醇共同培养巨噬泡沫细胞24h，采用荧光定量PCR的方法检测ABCA1和ABCG1mRNA的表达。 将10μMGGPP与100μM白藜芦醇共同培养巨噬泡沫细胞24h，再与10μg/mLapoAI孵育24h，荧光酶学法检测细胞和培养基中总胆固醇和游离胆固醇的含量。 研究结果： 1.巨噬泡沫细胞的鉴定用荧光酶学法检测巨噬泡沫细胞内胆固醇的含量，与正常对照组巨噬细胞相比，用ox—LDL处理巨噬细胞24h后，细胞内总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯的含量均明显增加，差异具有统计学意义(p<0.05)，说明巨噬泡沫细胞内有大量胆固醇的聚积，而且巨噬细胞内胆固醇酯与总胆固醇的比值达到51.620％，细胞已经泡沫化。 2.白藜芦醇对小鼠腹腔巨噬细胞增殖的影响10μM、50μM和100μM自藜芦醇作用细胞后，与对照组相比，吸光度值的差异无统计学意义(p>0.05)，说明该浓度白藜芦醇对巨噬细胞的增殖无明显影响，对巨噬细胞无明显毒性作用。 3.白藜芦醇促进apoAI诱导的小鼠腹腔巨噬泡沫细胞胆固醇的外流在无apoAI组，加入各浓度白藜芦醇培养巨噬泡沫细胞24h后，胆固醇(包括总胆固醇、游离胆固醇)的外流率有增加的趋势，然而差异无统计学意义(p>0.05)。 加入apoAI组，与Oh相比，白藜芦醇培养巨噬泡沫细胞12h～36h后，胆固醇(包括总胆固醇、游离胆固醇)的外流率明显增加，差异有统计学意义(p<0.05)，且在24h时，胆固醇的外流率达到最大，总胆固醇外流率和游离胆固醇外流率与对照组相比分别增加了78.87％和110.96％。结果表明白藜芦醇能够促进经apoAI途径的泡沫细胞胆固醇外流，这一作用存在一定程度的时间——效应关系。 加入apoAI组，当白藜芦醇作用时间为12h、24h和36h时，10μM、50μM和100μM白藜芦醇均能够提高巨噬泡沫细胞胆固醇(包括总胆固醇、游离胆固醇)的外流率，与对照组相比，差异具有统计学意义(p<0.05)，且在各个时间点，随着白藜芦醇浓度的增加，胆固醇的外流率随之增加，在剂量为100μM时外流率达到最大，说明白藜芦醇促进apoAI介导泡沫细胞胆固醇外流作用存在一定程度的剂量——效应关系。当各剂量白藜芦醇作用12h时，总胆固醇外流率和游离胆固醇外流率与对照组相比增加的百分比最高分别达到51.41％和43.61％；当各剂量白藜芦醇作用24h时，总胆固醇外流率和游离胆固醇外流率与对照组相比增加的百分比最高分别达到78.87％和110.96％；当各剂量白藜芦醇作用36h时，总胆固醇外流率和游离胆固醇外流率与对照组相比增加的百分比最高分别达到37.50％和43.21％。 4.白藜芦醇促进小鼠腹腔巨噬泡沫细胞ABCA1和ABCG1的表达10μM、50μM和100μM白藜芦醇培养巨噬泡沫细胞24h后，ABCA1mRNA的表达明显增加，各剂量组与对照组的差异具有统计学意义(p<0.05)，且随着白藜芦醇浓度的增加，ABCA1mRNA的表达显著增加，分别是对照组的5.24倍、14.92倍和63.65倍，存在明显的剂量——效应关系。 10μM、50μM和100μM白藜芦醇培养巨噬泡沫细胞24h后，ABCG1mRNA的表达明显增加，各剂量组与对照组的差异具有统计学意义(p<0.05)，且随着白藜芦醇浓度的增加，ABCG1mRNA的表达显著增加，分别是对照组的3.10倍、20.25倍和46.69倍，存在明显的剂量——效应关系。 5.放线菌素D阻断白藜芦醇诱导ABCA1和ABCG1表达5μg/mL放线菌素D与100μM白藜芦醇共同培养巨噬泡沫细胞24h后，白藜芦醇诱导ABCA1和ABCG1mRNA的表达明显降低，与白藜芦醇组相比，差异具有统计学意义(p=0.05)。 6.放线菌素D和ABCA1抑制剂阻断白藜芦醇诱导胆固醇的外流5μg/mL放线菌素D或400μMDIDS分别与100μM白藜芦醇共同培养巨噬泡沫细胞24h后，白藜芦醇诱导的巨噬泡沫细胞经apoAI途径胆固醇外流率降低，与白藜芦醇组相比，差异具有统计学意义(p<0.05)。 7.白藜芦醇促进小鼠腹腔巨噬泡沫细胞LXRα的表达10μM、50μM和100μM白藜芦醇培养巨噬泡沫细胞24h后，LXRαmRNA的表达增加，各剂量组与对照组的差异具有统计学意义(p<0.05)，且随着白藜芦醇浓度的增加，LXRαmRNA的表达增加，分别是对照组的1.63倍、9.45倍和11.52倍，存在明显的剂量——效应关系。 8.LXRα抑制剂阻断白藜芦醇诱导ABCA1、ABCG1表达和胆固醇的外流10μMGGPP与100μM白藜芦醇共同培养巨噬泡沫细胞24h后，白藜芦醇诱导ABCA1和ABCG1mRNA的表达明显降低，与白藜芦醇组相比，差异具有统计学意义(p<0.05)。GGPP还能抑制白藜芦醇诱导巨噬泡沫细胞经apoAI途径的胆固醇外流，与白藜芦醇组相比，差异具有统计学意义(p<0.05)。 结论 1.白藜芦醇可以促进apoAI介导的体外培养小鼠腹腔巨噬泡沫细胞胆固醇外流。 2.白藜芦醇可能通过LXRα—ABCA1/ABCG1-apoAI途径促进体外培养小鼠腹腔巨噬泡沫细胞胆固醇外流。