【摘 要】
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维生素D3是一种脂溶性的类固醇激素,在平衡新陈代谢、维持机体正常生长和健康等方面具有关键作用。随着合成生物学和代谢工程技术的发展,利用微生物底盘细胞绿色高效合成维生素D3是解决资源可持续发展的有效途径之一。7-脱氢胆固醇（7-dehydrocholesterol,7-DHC）是维生素D3的关键前体,7-DHC光异构化形成维生素D3。目前微生物合成7-DHC的方法存在细胞生长缓慢、代谢失衡、萜类等有
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维生素D3是一种脂溶性的类固醇激素,在平衡新陈代谢、维持机体正常生长和健康等方面具有关键作用。随着合成生物学和代谢工程技术的发展,利用微生物底盘细胞绿色高效合成维生素D3是解决资源可持续发展的有效途径之一。7-脱氢胆固醇（7-dehydrocholesterol,7-DHC）是维生素D3的关键前体,7-DHC光异构化形成维生素D3。目前微生物合成7-DHC的方法存在细胞生长缓慢、代谢失衡、萜类等有毒中间代谢物积累等问题,因此,本论文以酿酒酵母CEN.PK2-1C为出发菌株,在胞内重构7-DHC的合成途径,利用代谢网络模型和CRISPRi系统协调细胞生长和产物积累的关系,并进一步提高7-DHC的合成量,最终获得了一株高产7-DHC的菌株。主要结果如下:（1）异源表达鸡来源的DHCR24基因,在酿酒酵母细胞内构建7-DHC合成的途径,7-DHC的产量为1.4 mg·L-1;进一步过表达MVA途径和后角鲨烯途径的关键基因（t HMG1、IDI1、ERG20、ERG1、ERG11）,同时将调控因子INO2的启动子更换为强启动子PPGK1,菌株7-DHC的产量达到51.6 mg·L-1。（2）基于细胞全局调控对7-DHC合成的代谢途径进行预测,并对预测出需要敲除的5个基因（GDH1、GDH3、SER2、MAE1、AAT1）进行单敲除和组合敲除,发现GDH1基因的单敲除可以明显提高菌株7-DHC的合成量,产量提高到101.5 mg·L-1;同时还发现,敲除GDH1后,菌株的最大比生长速度(μmax)提高了28%。（3）为了进一步提高菌株合成7-DHC的能力,在TY1转座子中插入DHCR24基因和ERG1基因,并利用Leu降解标签在平板上筛选出含有高拷贝数DHCR24和ERG1的单菌落;结合荧光定量PCR检测发现,DHCR24基因和ERG1基因的拷贝数与7-DHC的产量呈正相关;拷贝数最高的菌株中,7-DHC的产量提高了120%,达到223.3mg·L-1。（4）为了动态调控竞争途径的关键基因ERG6,构建CRISPRi系统,并结合流式细胞仪对该系统的可行性进行验证;随机筛选dcas9蛋白的结合位点,利用绿色荧光蛋白GFP表征不同位点的抑制强度;将最佳的抑制位点应用于改造菌株中,发现在不影响细胞生长的前提下,工程菌株7-DHC的产量进一步提高,摇瓶发酵产量达到365mg·L-1,在3 L发酵罐中发酵,发现7-DHC的产量达到1328 mg·L-1。
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