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研究背景和目的流行性乙型脑炎（epidemic encephalitis B）,也称为日本脑炎（Japaneseencephalitis,JE）,简称乙脑,是重要的虫媒病毒传染病,其病原体为乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）,简称乙脑病毒。本病1871年首先由日本报道,1924年首次分离出乙脑病毒,中国于1940年用血清学和病毒分离的方法确诊了乙脑病例。多数国家每2～15年出现1次乙脑流行。世界卫生组织（WHO）估计,目前每年乙脑发病约5万例,其中约1/3的病例死亡,存活者20%～40%留有神经麻痹和心理改变等严重后遗症,曾一度被称为“东方的瘟疫”,给社会和家庭造成了巨大的负担。一般认为,JEV在库蚊和野生水鸟之间的循环,猪是重要的扩散宿主。乙脑的传播媒介是蚊虫,在世界范围内已报道从30种不同的蚊虫体内分离出乙脑病毒,国内也有20余种,三带喙库蚊是其中对JEV易感性最高的蚊种,JEV通过三带喙库蚊在野生鸟类、人和家畜之间传播。一般来说虫媒病毒都具有宿主泛嗜性,除了鸟类和猪以外,JEV还可以感染绵羊、家燕、猴子、金黄地鼠、小白鼠并可致病。国内学者曾报道从云南、广西、广东、海南、安徽、贵州的蝙蝠检测到JEV血清抗体。但尚没有分离到JEV或检测到JEV核酸的报道。湖南省是我国乙脑发病较多的地区之一,湖南省的蝙蝠能否携带JEV?如果携带该病毒,与人类乙脑有无关系?为此我们进行了本调查。研究方法1.标本来源与制备2007年至2008年期间4次收集湖南部分地区的蝙蝠共851只。收集的蝙蝠鉴定种类后无菌解剖取脑组织标本,所取得标本放入1.5ml含RNAlater的冻存管中4℃运输送回实验室进一步处理。脑组织标本加Hanks缓冲溶液用高压消毒过的微量研磨器无菌研磨,研磨液离心后取部分上清进行PCR检测和细胞培养,剩余标本放置-80℃保存。2.RT-PCR以JEV的E蛋白基因区和C/prM蛋白基因区为靶序列设计了一对特异RT-PCR引物和两对通用RT-PCR引物。先用QIAamp Viral RNA Mini Kit（QIAGEN公司）提取脑组织研磨液中的核糖核酸（RNA）,用SUPERSCRIPTⅢ1ST STRAND（invitrogen公司）逆转录酶体系和随机引物进行逆转录（RT）合成cDNA;以逆转录产物cDNA为模板进行聚合酶链反应（PCR）检测所采集蝙蝠标本中的JEV有关基因片段。3.SYBR GreenⅠ实时RT-PCR①引用已得到证实和公认的JEV基因特异性引物,采用SYBR GreenⅠ实时RT-PCR方法对蝙蝠脑组织进行JEV特异基因片段检测。②将SYBR GreenⅠ实时RT-PCR判定为JEV阳性或可疑为阳性的脑组织上清液接种Vero细胞逐日观察细胞病变,并盲传3代,继续观察细胞变化情况。③取细胞液或脑组织上清液脑腔接种1～3天龄的BALB/c乳鼠,观察乳鼠发病情况,有可疑发病者,取脑组织继续盲传3代,如出现明显发病者再进行SYBR GreenⅠ实时RT-PCR鉴定。4.细胞培养将脑组织研磨液上清用每ml含有100单位青霉素和硫酸链霉素的Hanks缓冲溶液1:10稀释,将已培养好长成单层的Vero细胞弃去原培养基,加入稀释好的接种液置于37℃、5%CO2恒温细胞培养箱内吸附2 h,然后弃去吸附液,加入含2%小牛血清的RPMI-1640培养基（Vero细胞）继续培养。观察细胞变化,根据细胞是否发生病变（cytopathiceffect.CPF）判断病毒培养阴性或者阳性,若细胞形态有明显变化,如细胞圆缩、颗粒增多、融合成片或碎裂死亡判断为阳性,阳性者做进一步培养分离及分子生物学检测;若没有细胞形态变化做RT-PCR检测是否有病毒增殖,连续盲传三代,若仍未有形态变化且RT-PCR产物未扩增出目的基因片断就判断为阴性。5.乳鼠接种实验将检测到的阳性样本离心取上清液,颅内接种乳鼠,每只接种0.03 ml。每天观察2～3次,连续观察1周。接种后48h内死亡的乳鼠弃去,视为非特异死亡。乳鼠发病症状为:拒乳、抽搐、侧卧、弓背、直至死亡。若观察1周后无症状出现,则连续盲传,若盲传三代,仍未出现发病症状,且经RT-PCR检测未扩增出目的基因片断则判断为阴性。6.测序和基因分析①对RT-PCR扩增获得的目的基因进行测序;②测序结果利用GeneBank的BLAST软件进行在线同源性分析;③在GeneBank下载其他JEV序列,利用Clustal W进行多序列比对分析;④用MEGA4.0软件,采用Neighbor-Joining法,Jukes-Cantor模型做进化树分析。结果1.标本收集情况从2007年至2008年期间共4次到湖南部分地区收集蝙蝠。共收集了851只,属于2个科8个种。2个科分别为菊头蝠科（Rhinolophidae）和蝙蝠科（Vespertilionidae）;8个种分别为:中菊头蝠（Rhinolophus affinis）496只、大耳菊头蝠（Rhinolophus macrotis）7只、中华菊头蝠（Rhinolophus sinicus）20只、大足鼠耳蝠（Myotis ricketti）12只、皮氏菊头蝠（Rhinolophus pearsoni）2只、小菊头蝠（Rhinolophus blythi）4只、普通长翼蝠（Miniopterus schreibersi）293只、马铁菊头蝠（Rhinolophus ferrumequinum）17只。2.RT-PCR检测结果用RT-PCR方法从2007年所采集344份蝙蝠脑组织标本中检测出2份JEV阳性标本,分别来自湖南YY地区和SY地区,YY地区蝙蝠JEV的携带率为0.69%（1/144）,SY地区蝙蝠JEV的携带率为0.50%（1/200）。3.SYBR GreenⅠ实时RT-PCR检测结果用SYBR GreenⅠ实时RT-PCR方法从2008年所采集507份蝙蝠脑组织标本中检测到弱阳性10例,其中湖南YY地区4例和SY地区6例,YY地区蝙蝠JEV的携带率为2.67%（4/150）,SY地区蝙蝠JEV的携带率为1.68%（6/357）。4.细胞培养结果用细胞培养分离方法对12份阳性标本进行分离培养,从2007年样本的2例阳性样本中观察到Vero细胞明显病变结果,对2008年的10份阳性样本进行分离培养也观察到较明显的病变结果。5.乳鼠致病性乳鼠接种实验对12份阳性标本进行鉴定,其中2007年的2例阳性样本接种乳鼠在第五天出现明显的抽搐、侧卧、弓背症状;2008年的3例阳性样本接种乳鼠仅出现轻微的抽搐、侧卧、弓背症状的症状,另7例阳性样本接种乳鼠未出现明显症状。6.测序结果本次所检测的蝙蝠JEV分别与NAKAYAMA株、Nakayama-NIH株、YNDL04-45株成一个分支,都属于乙脑病毒基因型Ⅲ型。结论本研究表明栖息于湖南地区的蝙蝠携带JEV,但携带率不高:2007年收集的标本中,YY地区蝙蝠JEV的携带率为0.69%,SY地区携带率为0.50%;2008年收集的标本中,YY地区蝙蝠JEV携带率为2.67%,SY地区携带率为1.68%。对从2007年样本中所检测出的2份乙脑病毒阳性样本进行测序以及基因序列分析,序列与NAKAYAMA株、Nakayama-NIH株、YNDL04-45株序列同源性为96%～100%。