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牛γ干扰素(BoIFN-y)是特异性抗原或有丝分裂原刺激机体后,主要由CD4+Th1细胞、CD8+T细胞及NK细胞等所分泌表达的一种细胞因子,具有广谱抗病毒、抑制细胞增殖和免疫调节等多种生物学功能。IFN-γ可以作为免疫佐剂,增强疫苗的免疫效果。机体IFN-γ水平的高低在很大程度上可以反映机体的细胞免疫状态,而抗原特异性的IFN-γ反应则可以作为机体针对某种特定外来抗原的细胞免疫状态的指标。因此,制备针对BoIFN-γ特异性单抗,并以此建立抗原特异性的BoIFN-γ免疫学检测方法,可以进行牛结核等感染性疾病的诊断。本研究应用Flp-In-293细胞成功构建了可以稳定表达BoIFN-γ的细胞系。同时,应用特异性单克隆抗体建立了检测评价BoIFN-γ的夹心ELISA方法。从重组质粒pVAX1-preBoIFN-γ中扩增出preBoIFN-γ片段,构建重组质粒pCR2.1-preBoIFN-γ并进行测序；将测序正确的重组质粒使用KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后,将酶切片段连接至表达载体pcDNA3.1-FLAG,构建瞬时表达质粒pcDNA3.1-preBoIFN-γ-FLAG;然后使用XbaⅠ和ApaⅠ双酶切,将酶切片段连接克隆至表达载体pcDNA5/FRT并进行测序,构建表达载体pcDNA5/FRT-preBoIFN-γ-FLAG。将重组质粒pcDNA3.1-preBoIFN-γ-FLAG瞬时转染COS-1细胞,孵育48小时后,间接免疫荧光鉴定结果显示BoIFN-y在COS-1细胞中得到成功表达；采用脂质体转染法,将重组质粒pcDNA5/FRT-preBoIFN-γ-FLAG与重组酶表达载体pOG44共转染Flp-In-293细胞,孵育48小时后,用含120μg/ml Hygromycin B的完全培养基进行抗性筛选,3-4周后挑取克隆扩大培养,并进行亚克隆,使用ELISA、胞内染色、免疫印迹等方法进行鉴定,将阳性克隆细胞系命名为B1。结果显示,BoIFN-y得到成功表达,并且主要以分泌形式表达到细胞上清中,p-半乳糖苷酶活性及Zeocin抗性分析表明,经过有限稀释法纯化后获得的细胞克隆,不再具有lacZ-Zeo融合蛋白活性,目的蛋白可以稳定表达。通过诱导表达重组大肠杆菌BL21(DE3)(pET-30a-BoIFN-y)和BL21(pGEX-6p-1-BoIFN-γ),并对表达产物进行亲和层析纯化得到重组蛋白His-BoIFN-γ和GST-BoIFN-γ;以一定量的P3代重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,感染后96h左右,待细胞病变明显时收集上清,对上清进行处理后得到Bac-BoIFN-γ;牛尾静脉无菌采集肝素钠抗凝血,加入适量美洲商陆(PWM)后,置于37℃细胞培养箱刺激培养24h,收集上清获得天然BoIFN-γ。使用微量细胞病变抑制法,通过MDBK/VSV细胞系统分别测定重组蛋白His-BoIFN-γ、 GST-BoIFN-γ、Bac-BoIFN-γ、FLAG-BoIFN-γ和天然BoIFN-y的抗病毒活性,结果显示其抗病毒效价分别达到8.389×107U/mg、6.554×105U/mg、4.069×104U/ml、1.024×104U/ml和1.28×103U/ml,具有较高抗病毒活性牛γ干扰素的获得为其开发应用提供了重要的生物材料。抗病毒分析方法(Antiviral assay, AVA)是第一个建立起来的检测干扰素样品相对活性或效能的生物学方法,现有的干扰素生物学活性鉴定方法普遍存在费时、繁琐、不够精确、特异性差等一系列缺陷,亟待改进。本研究使用针对BoIFN-γ的单克隆抗体建立抗原特异性的双抗夹心ELISA方法,并绘制标准曲线,用于各种重组BoIFN-γ的抗病毒活性定量分析,该方法更为安全、便捷、准确,为BoIFN-γ的生物学功能、作用机理的研究及临床应用提供了有效的手段,并为BoIFN-γ的进一步研究应用奠定了重要的基础。