论文部分内容阅读
花色素苷等黄酮类物质具有较强的抗氧化能力,能防止和治疗许多慢性疾病,尤其是对糖尿病、癌症和溃疡的治疗有很大的作用。越橘(Vaccinium spp.)果实中,花色素苷是最主要的生理活性物质,其生物合成途径也是越橘果实发育过程中最重要的次生代谢途径之一。挖掘与花色素苷合成相关的基因资源对于我们今后采用分子生物学手段培育越橘新品种具有重要意义。但是传统测序手段固有的缺陷再加上越橘现有遗传信息的匮乏,导致目前无法对越橘重要的次生代谢产物形成的分子机制进行深入研究和探讨。本研究采用高通量测序技术(Illumina/Solexa)对越橘果实进行转录组测序,全面分析果实成熟期的基因表达变化,挖掘与花色素苷等黄酮类物质合成相关的基因和转录调控因子；采用荧光定量PCR技术分析越橘果实发育过程中的基因表达变化,测定果实不同发育阶段花色素苷的含量,分析基因表达与其酶活性和花色素苷累积的关系；利用RT-PCR和RACE技术对越橘花色素苷合成途径中的关键酶基因进行全长克隆与序列分析,为深入研究越橘花色素苷合成的分子机制奠定基础。主要研究结果如下：1应用Illumina/Solexa测序平台对越橘果实的果肉组织(对照)和果皮组织两份材料进行转录组测序。测序共获得64312746个reads(75bp的短序列),序列已上传至NCBI的Sequence Read Archive数据库,登陆号：SRA046311。2利用生物信息学手段,根据reads末端重复序列进行组装和拼接,共获得34464条All-unigene。All-unigene序列平均长度735bp,长度大于1000nt的序列有7812条(占22.66%),没有碱基缺失(gap)的All-unigene有32032条(占92.3%)。3将获得的All-unigene和已知的蛋白质数据库NR、Swiss-Prot、KEGG和COG进行比对(E-value<1.0e-5),对其功能进行注释。结果发现有25376(占73.6%)条序列得到了功能注释,而9088(占26.4%)条序列的功能是未知的；根据NR数据库注释的信息,共有8498条All-unigene映射到GO不同的节点(term),并按照分子功能(Molecular function)、细胞组分(Cellular component)及参与的生物过程(Biological process)对这些基因进行分类；在COG功能分类中,有9175个All-unigene被分成了25个类别。4通过与KEGG数据库比对,有12547个All-unigene参与119个不同的生物学途径(Pathway),其中参与代谢途径(Metabolic pathways)的All-unigene最多(有2982个),其次是参与次生代谢生物合成途径(Biosynthesis of secondary metabolites)的All-unigene较多(有1568个)。并发现1236个All-unigene参与了19条与花色素苷等抗氧化相关的次生代谢途径。5通过与公共数据库比对,对基因编码蛋白框(CDS)和序列的方向进行预测,获得25436个CDS(5’-3’),1000bp以上的序列有5229条,占20.6%。6对果肉和果皮两个测序文库进行差异比较分析,有9703个All-Unigene存在显著差异(FDR≤0.001且|log2Ratio|≥1);在果皮文库中有76个高表达的转录本(|log2Ratio|≥15),最高表达的是脂肪酶家族蛋白基因(GDSL);有2171个差异表达基因(DEG)映射到GO不同的节点,内在膜蛋白(Intrinsic to membrane)是最显著富集的GO功能条目；有3176个DEGs注释到116条代谢途径,其中有28条是显著富集的Pathway (Qvalue≤0.05),620个DEGs参与的次生代谢物质的生物合成代谢途径最显著富集。7在转录组文库中发现862个All-unigenes编码超过22种不同类别的转录因子(TF),其中与花色素苷等黄酮类物质生物合成相关的TFs主要有：MYB(117个)、WD40(91个)、WRKY (63个)、AP2(53个)和bHLH(5个)等。8在差异表达文库中筛选获得92条All-unigene可能编码黄酮类物质生物合成途径中的14个关键酶；从上调基因中筛选在果皮中表达量最高的Unigene938_All(编码苯丙氨酸解氨酶,PAL)、Unigene23486_All(编码查耳酮合酶,CHS)、Unigene7743_All (编码黄烷酮3-羟基化酶,F3H)、Unigene8103_All(编码二氢黄酮醇还原酶,DFR)和Unigene26381_All编码花色素合酶,ANS)进行荧光定量PCR验证和表达分析,结果发现在整个果实发育过程中都能检测到基因的表达,并且这5个基因的表达变化趋势一致,花期和果实成熟期基因的表达量较高,绿果期最低,果皮组织中最高。9对越橘果实不同发育阶段的花色素苷含量进行测量,结果发现从绿果期到果实成熟期,花色素苷的相对含量与PAL、CHS、F3H、DFR和ANS这5个基因的相对表达量变化呈现一致性,二者都是在果皮组织中的含量达到最高,且显著高于其它组织和器官。10利用RT-PCR(?)(?)RACE技术从越橘果皮组织中克隆了花色素合酶(ANS)基因的全长cDNA,命名为VcANS, GenBank登录号为JN654701。序列分析结果表明,VcANS全长1424bp,包含93bp的5′非编码区(5’UTR)、248bp的3′非编码区(3’UTR)和一个长度为1083bp编码360个氨基酸的开放阅读框(ORF)；该基因编码的蛋白具有ANS家族普遍存在的2-酮戊二酸和Fe2+-依赖的氧化酶超家族的保守结构域；序列比对和系统进化分析表明,VcANS与杜鹃花科植物亲缘关系最近。