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背景
蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是神经科常见的急性脑卒中之一，常为急性发病，典型的症状体征表现为头痛、恶心呕吐和脑膜刺激征，伴或不伴局灶体征，部分患者可表现为轻微头痛，腰痛等。多数患者于活动中起病，如剧烈活动，颅脑外伤或者饮酒等，也有部分患者是安静状态起病。SAH多由动脉瘤破裂引起，部分患者可因外伤、感染等其他原因引起。SAH有极高的致死致残率，在临床工作中对SAH的诊断和治疗面临着很大的挑战。过去基于脑血管痉挛和神经元损伤的研究，认为SAH的治疗在于控制出血后的脑血管痉挛，然而据国外针对控制血管痉挛治疗后患者预后情况的统计，在出血后积极控制脑血管痉挛，对患者的预后并无明显的改善，多数患者仍遗留有认知障碍和神经功能缺损症状，结果不善人意。
在2004年Kusaka提出了SAH的早期脑损伤(early brain injury，EBI)概念后，对SAH的早期脑损伤研究越来越受到关注。EBI指的是在SAH出血发生后72小时内，脑血管痉挛发生前，脑组织出现的病灶。EBI的发生机制包括了出血的机械损伤、脑组织的分子水平改变、微循环障碍、皮层扩散障碍及神经元凋亡等多个病理生理改变。目前研究发现，在人和动物的SAH模型中，出血早期就能在大脑皮层、皮层下及海马等区域发现凋亡的神经细胞。针对EBI的神经元凋亡通路研究也发现了神经元凋亡的细胞水平表观遗传学改变。
表观遗传是指不改变DNA序列的情况下，使基因的表达发生改变并且可以通过一定的方式进行遗传，其包括了组蛋白修饰、DNA甲基化染色体重塑和非编码RNA调控等。组蛋白的乙酰化和去乙酰化是组蛋白翻译后修饰方式之一，在细胞的增殖、分化和凋亡中起到至关重要的作用，分别主要依靠组蛋白乙酰化转移酶(histone acetyl-transferases，HATs)和组蛋白去乙酰化转移酶(histone deacetylases, HDACs)，两者数量和活性的平衡，是保持神经元正常活性的重要条件。组蛋白乙酰化酶转录辅激活酶5(general control non-derepressible-5，GCN5)是HATs家族的成员之一，其仅存于核内，与基因的转录调控密切相关。我们的早期研究发现，通过抑制剂或者小分子RNA干预使GCN5活性的缺失，可导致神经元凋亡的产生。
由于神经元一旦发生凋亡后就是不可逆的损伤，目前在神经影像学方面大量的研究致力于寻找EBI病灶，应用较为的是广泛的是经颅多普勒(transcranial doppler，TCD)和CT灌注成像(computed tomographic perfusion，CTP)，这两种检查方式并不能给临床上确定EBI的发生区域带来直接客观的反映。而质子磁共振波谱(1H-magnetic resonance spectroscopy，1H-MRS)作为一种体外无创的技术，目前在临床上也逐渐普及。1H-MRS能够测量局部脑组织代谢物的含量和相对浓度，为EBI确定病灶带来新的思路。目前常用的检测指标有N-乙酰天门冬氨酸(N-acetylaspanate, NAA)、胆碱复合物(choline, Cho)、乳酸(lactic acid， Lac)及肌酸(creatine, Cr)等。NAA是目前的神经元特异性指标，其峰值和相对浓度的高低反应了神经元的活性或者缺失情况。Cho是胆碱复合物，MRS检测的Cho峰信号来源于细胞转换过程中游离的水溶性胆碱成分而非固定在细胞膜内的胆碱，包括了甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱及磷酸胆碱的胆碱复合物，Cho峰值的高低反应了细胞膜的状态。Lac，是无氧代谢的产物，在正常脑组织中MRS基本上检测不到，Lac峰的出现常提示了无氧代谢的增强，反映了脑组织的缺氧状态。由于Cr在各种生理病理情况下其浓度均保持相对的恒定，常用来作为脑代谢物测量的内参。
目的
本课题以颅内动脉穿刺法(puncture of intracranial artery，PIC)建立大鼠SAH模型，观察大鼠的饮食及神经功能缺损情况，检测脑组织的病理改变及GCN5相关产物的变化情况，检测SAH后大鼠脑组织代谢物的改变，探讨大鼠SAH的表观遗传学机制和1H-MRS影像学表现。
方法
1.动物分组和SAH模型的建立
1.1分组
45只成年SD大鼠随机分成4组，假手术组(sham-operatedgroup，n=8)、SAH模型组(subarachnoidhemorrhagegroup，SAHgroup，n=22)、溶剂对照组(vehiclegroup，n=6)及药物处理组(SAHAgroup，n=7)。
1.2溶剂对照组及给药组在建模前24小时处理
在SAH模型建立前24小时，通过立体定位仪及微量注射泵，组向大鼠右侧侧脑室注射一定体积的溶剂和药物，溶剂对照组注射溶媒，药物对照组注射溶媒及药物。
1.3SAH模型的建立
在给药处理24小时后，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，取仰卧位，颈部正中切口，在外科显微镜下操作，暴露大鼠的左侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，结扎并切断颈外动脉远心端，从近心端开口刺入锐化的尼龙丝进入颈内动脉，感到阻力后继续进入2mm，回抽尼龙丝并结扎颈外动脉近心端，即可形成SAH模型。假手术组在感到阻力后不刺穿颈内动脉。
2.大鼠的饮食及神经行为学评分
观察SAH出血24小时后大鼠的进食情况，并对其神经功能行为学进行评分，观察SAH对大鼠神经功能的影响及SAHA的干预作用。
3.出血及药物干预后大鼠脑皮层的神经病学观察
3.1脑组织取材、冰冻切片及石蜡包埋和制片
在SAH模型建立后24小时，从各组随机选取大鼠，假手术组4只，SAH组5只，vehicle组4只，SAHA组4只，麻醉后经心脏灌注固定，断头取脑，经梯度蔗糖脱水后冰冻切片或脱水透明、浸蜡包埋。
3.2神经病理染色
冰冻组织作冠状位连续切片(厚度20μm)，使用免疫荧光检测法检测各组大鼠皮层的GCN5相关蛋白，观察SAH出血后24小时大鼠脑蛋白表达情况及药物SAHA对大鼠出血后EBI的干预作用。
石蜡组织作连续冠状位连续切片(厚度4μm)，苏木素-伊红染色后在光学显微镜下观察。假手术组及SAH组使用TUNNEL法检测，在荧光倒置显微镜下观察两组大鼠脑的神经元凋亡情况。
4.Westernblot检测大鼠前额叶皮层GCN5相关蛋白
4.1脑组织取材及匀浆定量处理
大鼠经腹腔注射水合氯醛麻醉后灌注，断头取脑，选取前额叶组织，将脑组织置于预先放在冰上冷却的玻璃匀浆器中，加入适量组织蛋白裂解液(RIPA裂解液)。离心后取上清液，用紫外分光光度计测定蛋白浓度后配平至统一浓度。
4.2测定脑组织蛋白表达情况
蛋白经处理后使用WesternBlot检测脑组织目标蛋白，观察出血及药物干预后大鼠脑组织GCN5相关蛋白表达情况。
5.1H-MRS检测大鼠脑组织代谢物
SAH模型建立后24小时，选取假手术组(n=4)及SAH组(n=8只)大鼠，用水合氯醛经腹腔注射麻醉后置于专用的大鼠脑组织线圈中，用Phillip3.0T磁共振扫描大鼠脑组织，获取T1WI、T2WI及MRS图像。
6.数据统计分析
应用ImageJ图文分析系统对免疫荧光结果在获取图像分析平均光密度，对WesternBlot结果进行灰度分析。应用SPSS16.0统计软件对实验数据进行分析，采用独立样本t检验及方差齐性检验，结果以均数±标准差(-x±s)表示。所有统计结果以p＜0.05为差异具有统计学意义。
结果
1.大鼠进食情况及神经功能行为学评分
1.1SAH组大鼠与假手术组对比进食量减低；Vehicle组大鼠进食量与SAH组对比无明显差异；SAHA组大鼠进食量对比Vehicle组有所增加。
1.2SAH组大鼠神经功能行为学评分明显高于假手术组，差异具有统计学意义(p＜0.05)；Vehicle组与SAH组对比无明显差异，结果无统计学意义(p＞0.05)；SAHA组大鼠进对比Vehicle组有所减低，差异有统计学意义(p＜0.05)。
2.大鼠神经病理学分析
2.1苏木素-伊红染色中可观察到SAH组大鼠的额叶皮层存在神经元细胞核的形态学改变，假手术组未见明显改变区域。TUNNEL法检测凋亡的神经细胞可见SAH组大鼠存在神经元凋亡，假手术组大鼠无凋亡产生。
2.2免疫荧光可见SAH组大鼠脑组织蛋白ActiveCaspase3、Bim及Egr-1表达比假手术组明显升高，GCN5水平对比假手术组明显降低。
3.WesternBlot结果
3.1SAH组大鼠脑组织蛋白中，Bim、Egr-1、E2F1、ActiveCaspase3的表达情况对比假手术组明显升高，GCN5及Bcl-2对比假手术组表达降低。
3.2SAHA组大鼠脑组织的Bim、Egr-1、E2F1及ActiveCaspase3表达比vehicle组降低，Bcl-2表达比vehicle组升高。
4.1H-MRS检测大鼠脑组织代谢物相对浓度提示SAH组的NAA/Cr比值及NAA/Cho比值与假手术组对比有所降低，其中NAA/Cr比值差异无统计学意义(p＞0.05)，NAA/Cho比值差异有统计学意义(p＜0.05)；Cho/Cr比值SAH组比假手术组升高，且两者差异有统计学意义。在1.33ppm处，SAH组大鼠可见倒置双峰，而假手术组并未出现。T2WI序列可见SAH组大鼠有脑组织损伤区域，而假手术组在所有层面均未见明显异常。
结论
1.SAH出血发生后24小时，大鼠的进食和神经功能行为学减弱，药物干预后大鼠的总体情况有所改善,与SAHA抑制了HDACs活性，使得EBI的神经元凋亡减少有关。
2.SAH组大鼠的大脑皮层可观察到神经元细胞核形态改变及明显的神经元凋亡区域，也就是说在出血后24小时已经发生了明显的EBI。
3.在大鼠出血24小时后，GCN5蛋白的表达降低，同时其下游产物也有相对应的变化趋势；使用HDACs抑制剂SAHA干预后大鼠脑组织蛋白表达水平有所改善，即GCN5的活性缺失导致了神经元的凋亡。
4.1H-MRS分析结果提示：①神经元发生了凋亡和细胞膜受损；②EBI后脑组织的有氧代谢受到抑制，无氧代谢增加，脑组织处于缺血缺氧状态；③EBI发生但不局限于大脑皮层，基底节区等也可出现明显的损伤病灶。
蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是神经科常见的急性脑卒中之一，常为急性发病，典型的症状体征表现为头痛、恶心呕吐和脑膜刺激征，伴或不伴局灶体征，部分患者可表现为轻微头痛，腰痛等。多数患者于活动中起病，如剧烈活动，颅脑外伤或者饮酒等，也有部分患者是安静状态起病。SAH多由动脉瘤破裂引起，部分患者可因外伤、感染等其他原因引起。SAH有极高的致死致残率，在临床工作中对SAH的诊断和治疗面临着很大的挑战。过去基于脑血管痉挛和神经元损伤的研究，认为SAH的治疗在于控制出血后的脑血管痉挛，然而据国外针对控制血管痉挛治疗后患者预后情况的统计，在出血后积极控制脑血管痉挛，对患者的预后并无明显的改善，多数患者仍遗留有认知障碍和神经功能缺损症状，结果不善人意。
在2004年Kusaka提出了SAH的早期脑损伤(early brain injury，EBI)概念后，对SAH的早期脑损伤研究越来越受到关注。EBI指的是在SAH出血发生后72小时内，脑血管痉挛发生前，脑组织出现的病灶。EBI的发生机制包括了出血的机械损伤、脑组织的分子水平改变、微循环障碍、皮层扩散障碍及神经元凋亡等多个病理生理改变。目前研究发现，在人和动物的SAH模型中，出血早期就能在大脑皮层、皮层下及海马等区域发现凋亡的神经细胞。针对EBI的神经元凋亡通路研究也发现了神经元凋亡的细胞水平表观遗传学改变。
表观遗传是指不改变DNA序列的情况下，使基因的表达发生改变并且可以通过一定的方式进行遗传，其包括了组蛋白修饰、DNA甲基化染色体重塑和非编码RNA调控等。组蛋白的乙酰化和去乙酰化是组蛋白翻译后修饰方式之一，在细胞的增殖、分化和凋亡中起到至关重要的作用，分别主要依靠组蛋白乙酰化转移酶(histone acetyl-transferases，HATs)和组蛋白去乙酰化转移酶(histone deacetylases, HDACs)，两者数量和活性的平衡，是保持神经元正常活性的重要条件。组蛋白乙酰化酶转录辅激活酶5(general control non-derepressible-5，GCN5)是HATs家族的成员之一，其仅存于核内，与基因的转录调控密切相关。我们的早期研究发现，通过抑制剂或者小分子RNA干预使GCN5活性的缺失，可导致神经元凋亡的产生。
由于神经元一旦发生凋亡后就是不可逆的损伤，目前在神经影像学方面大量的研究致力于寻找EBI病灶，应用较为的是广泛的是经颅多普勒(transcranial doppler，TCD)和CT灌注成像(computed tomographic perfusion，CTP)，这两种检查方式并不能给临床上确定EBI的发生区域带来直接客观的反映。而质子磁共振波谱(1H-magnetic resonance spectroscopy，1H-MRS)作为一种体外无创的技术，目前在临床上也逐渐普及。1H-MRS能够测量局部脑组织代谢物的含量和相对浓度，为EBI确定病灶带来新的思路。目前常用的检测指标有N-乙酰天门冬氨酸(N-acetylaspanate, NAA)、胆碱复合物(choline, Cho)、乳酸(lactic acid， Lac)及肌酸(creatine, Cr)等。NAA是目前的神经元特异性指标，其峰值和相对浓度的高低反应了神经元的活性或者缺失情况。Cho是胆碱复合物，MRS检测的Cho峰信号来源于细胞转换过程中游离的水溶性胆碱成分而非固定在细胞膜内的胆碱，包括了甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱及磷酸胆碱的胆碱复合物，Cho峰值的高低反应了细胞膜的状态。Lac，是无氧代谢的产物，在正常脑组织中MRS基本上检测不到，Lac峰的出现常提示了无氧代谢的增强，反映了脑组织的缺氧状态。由于Cr在各种生理病理情况下其浓度均保持相对的恒定，常用来作为脑代谢物测量的内参。
目的
本课题以颅内动脉穿刺法(puncture of intracranial artery，PIC)建立大鼠SAH模型，观察大鼠的饮食及神经功能缺损情况，检测脑组织的病理改变及GCN5相关产物的变化情况，检测SAH后大鼠脑组织代谢物的改变，探讨大鼠SAH的表观遗传学机制和1H-MRS影像学表现。
方法
1.动物分组和SAH模型的建立
1.1分组
45只成年SD大鼠随机分成4组，假手术组(sham-operatedgroup，n=8)、SAH模型组(subarachnoidhemorrhagegroup，SAHgroup，n=22)、溶剂对照组(vehiclegroup，n=6)及药物处理组(SAHAgroup，n=7)。
1.2溶剂对照组及给药组在建模前24小时处理
在SAH模型建立前24小时，通过立体定位仪及微量注射泵，组向大鼠右侧侧脑室注射一定体积的溶剂和药物，溶剂对照组注射溶媒，药物对照组注射溶媒及药物。
1.3SAH模型的建立
在给药处理24小时后，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，取仰卧位，颈部正中切口，在外科显微镜下操作，暴露大鼠的左侧颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，结扎并切断颈外动脉远心端，从近心端开口刺入锐化的尼龙丝进入颈内动脉，感到阻力后继续进入2mm，回抽尼龙丝并结扎颈外动脉近心端，即可形成SAH模型。假手术组在感到阻力后不刺穿颈内动脉。
2.大鼠的饮食及神经行为学评分
观察SAH出血24小时后大鼠的进食情况，并对其神经功能行为学进行评分，观察SAH对大鼠神经功能的影响及SAHA的干预作用。
3.出血及药物干预后大鼠脑皮层的神经病学观察
3.1脑组织取材、冰冻切片及石蜡包埋和制片
在SAH模型建立后24小时，从各组随机选取大鼠，假手术组4只，SAH组5只，vehicle组4只，SAHA组4只，麻醉后经心脏灌注固定，断头取脑，经梯度蔗糖脱水后冰冻切片或脱水透明、浸蜡包埋。
3.2神经病理染色
冰冻组织作冠状位连续切片(厚度20μm)，使用免疫荧光检测法检测各组大鼠皮层的GCN5相关蛋白，观察SAH出血后24小时大鼠脑蛋白表达情况及药物SAHA对大鼠出血后EBI的干预作用。
石蜡组织作连续冠状位连续切片(厚度4μm)，苏木素-伊红染色后在光学显微镜下观察。假手术组及SAH组使用TUNNEL法检测，在荧光倒置显微镜下观察两组大鼠脑的神经元凋亡情况。
4.Westernblot检测大鼠前额叶皮层GCN5相关蛋白
4.1脑组织取材及匀浆定量处理
大鼠经腹腔注射水合氯醛麻醉后灌注，断头取脑，选取前额叶组织，将脑组织置于预先放在冰上冷却的玻璃匀浆器中，加入适量组织蛋白裂解液(RIPA裂解液)。离心后取上清液，用紫外分光光度计测定蛋白浓度后配平至统一浓度。
4.2测定脑组织蛋白表达情况
蛋白经处理后使用WesternBlot检测脑组织目标蛋白，观察出血及药物干预后大鼠脑组织GCN5相关蛋白表达情况。
5.1H-MRS检测大鼠脑组织代谢物
SAH模型建立后24小时，选取假手术组(n=4)及SAH组(n=8只)大鼠，用水合氯醛经腹腔注射麻醉后置于专用的大鼠脑组织线圈中，用Phillip3.0T磁共振扫描大鼠脑组织，获取T1WI、T2WI及MRS图像。
6.数据统计分析
应用ImageJ图文分析系统对免疫荧光结果在获取图像分析平均光密度，对WesternBlot结果进行灰度分析。应用SPSS16.0统计软件对实验数据进行分析，采用独立样本t检验及方差齐性检验，结果以均数±标准差(-x±s)表示。所有统计结果以p＜0.05为差异具有统计学意义。
结果
1.大鼠进食情况及神经功能行为学评分
1.1SAH组大鼠与假手术组对比进食量减低；Vehicle组大鼠进食量与SAH组对比无明显差异；SAHA组大鼠进食量对比Vehicle组有所增加。
1.2SAH组大鼠神经功能行为学评分明显高于假手术组，差异具有统计学意义(p＜0.05)；Vehicle组与SAH组对比无明显差异，结果无统计学意义(p＞0.05)；SAHA组大鼠进对比Vehicle组有所减低，差异有统计学意义(p＜0.05)。
2.大鼠神经病理学分析
2.1苏木素-伊红染色中可观察到SAH组大鼠的额叶皮层存在神经元细胞核的形态学改变，假手术组未见明显改变区域。TUNNEL法检测凋亡的神经细胞可见SAH组大鼠存在神经元凋亡，假手术组大鼠无凋亡产生。
2.2免疫荧光可见SAH组大鼠脑组织蛋白ActiveCaspase3、Bim及Egr-1表达比假手术组明显升高，GCN5水平对比假手术组明显降低。
3.WesternBlot结果
3.1SAH组大鼠脑组织蛋白中，Bim、Egr-1、E2F1、ActiveCaspase3的表达情况对比假手术组明显升高，GCN5及Bcl-2对比假手术组表达降低。
3.2SAHA组大鼠脑组织的Bim、Egr-1、E2F1及ActiveCaspase3表达比vehicle组降低，Bcl-2表达比vehicle组升高。
4.1H-MRS检测大鼠脑组织代谢物相对浓度提示SAH组的NAA/Cr比值及NAA/Cho比值与假手术组对比有所降低，其中NAA/Cr比值差异无统计学意义(p＞0.05)，NAA/Cho比值差异有统计学意义(p＜0.05)；Cho/Cr比值SAH组比假手术组升高，且两者差异有统计学意义。在1.33ppm处，SAH组大鼠可见倒置双峰，而假手术组并未出现。T2WI序列可见SAH组大鼠有脑组织损伤区域，而假手术组在所有层面均未见明显异常。
结论
1.SAH出血发生后24小时，大鼠的进食和神经功能行为学减弱，药物干预后大鼠的总体情况有所改善,与SAHA抑制了HDACs活性，使得EBI的神经元凋亡减少有关。
2.SAH组大鼠的大脑皮层可观察到神经元细胞核形态改变及明显的神经元凋亡区域，也就是说在出血后24小时已经发生了明显的EBI。
3.在大鼠出血24小时后，GCN5蛋白的表达降低，同时其下游产物也有相对应的变化趋势；使用HDACs抑制剂SAHA干预后大鼠脑组织蛋白表达水平有所改善，即GCN5的活性缺失导致了神经元的凋亡。
4.1H-MRS分析结果提示：①神经元发生了凋亡和细胞膜受损；②EBI后脑组织的有氧代谢受到抑制，无氧代谢增加，脑组织处于缺血缺氧状态；③EBI发生但不局限于大脑皮层，基底节区等也可出现明显的损伤病灶。