卵子发生和卵黄发生构成了动物卵巢发育的基本过程,卵黄发生的本质是卵巢卵母细胞中卵黄物质的大量积累。卵黄蛋白原（Vitellogenin,Vg）是卵黄发生过程的关键基因。Vg蛋白可与糖类、脂类等营养物质共同加工形成卵黄磷蛋白（vitellin,Vn）,后者是卵黄物质最主要的蛋白质之一。因此,雌体动物体内Vg的表达和合成将会影响卵巢中卵黄物质的积累进而影响动物卵巢发育的进程。中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）是我国重要的经济蟹类,在其卵巢发育期间具有卵黄蛋白爆发性积累的特征,因而成为卵黄发生研究的极佳模型。对于多数卵生脊椎动物,类固醇激素在卵黄发生的内分泌调控过程中扮演着重要角色,其对于Vg基因转录水平的作用及机制已较清楚。但在中华绒螯蟹中,由于部分关键类固醇受体（steroid receptor,SR）的缺失,类固醇激素对其卵黄发生的调控作用仍不明确,其作用机制也因此更为扑朔。本文以中华绒螯蟹为研究对象,首先对其Vg表达和分布的内源性特征进行了明确;随后对内源性雌激素的特征及其同Vg/Vn蛋白的潜在关系进行了预测和推断;再探究了雌激素和蜕皮激素对Vg-mRNA的表达调控作用;在确定了两种类固醇激素的作用后,最终对类固醇激素调控Vg表达的潜在基因组途径进行了探索。主要研究结果如下:1.中华绒螯蟹卵黄蛋白原基因及其受体在不同卵巢发育时期的表达和定位原位杂交结果显示,肝胰腺Vg-mRNA主要分布于吸收细胞（Resorptive cell,R细胞）和纤维细胞（Fibrillar cell,F细胞）中,不同卵黄发生的分布差异较小,阳性信号强度有增强趋势;在卵巢中,Vg-mRNA信号主要在滤泡细胞、内源性卵黄合成期卵母细胞胞质以及外源性卵黄合成期卵母细胞核中出现。实时荧光定量PCR（RT-q PCR）结果显示,Vg-mRNA的表达在卵巢发育Ⅰ-Ⅳ期的肝胰腺和卵巢中持续上升,且两者均在Ⅲ期出现剧烈的上升,而卵巢的Vg-mRNA水平则会在V期显著下降。卵巢中卵黄蛋白原受体基因（Vg R）的表达则在Ⅲ-Ⅳ维持着相对较高的水平,Ⅰ期、Ⅱ期和V期的表达量之间无显著差异。免疫荧光结果显示,肝胰腺中Vg/Vn的阳性信号在卵巢发育全期均可检测到,信号强度整体呈现出由弱渐强的趋势,阳性信号主要在F细胞和R细胞中被检测到;就卵巢而言,Ⅰ期卵巢卵原细胞或是卵黄合成前卵母细胞中并未检测到免疫阳性;Ⅱ期卵巢,Vg/Vn阳性信号主要存在于内源性卵黄合成期卵母细胞胞质;Ⅲ期内外源性卵黄合成期卵母细胞中都可观察到Vg/Vn的信号;Ⅳ期和V期的卵巢中,近成熟期卵母细胞和成熟期卵母细胞出现了较强的Vg/Vn免疫反应。以上结果表明,中华绒螯蟹卵黄发生有着显著的内外源性卵黄合成分期特点,内源性时期卵黄合成的主要贡献者为卵巢,而外源性卵黄合成的主要贡献者为肝胰腺。2.17β雌二醇与中华绒螯蟹卵黄蛋白的含量变化和分布的关系首先通过酶联免疫吸附测定（ELISA）对不同卵巢发育时期血淋巴、肝胰腺和卵巢中的17β雌二醇（E2）含量进行了测定。Ⅰ期和Ⅱ期血淋巴中的E2浓度明显较低于其他三期,且I期血淋巴的E2浓度最低,为31.91 pg m L-1;肝胰腺中,E2含量仍在Ⅰ期时最低(91.49 pg g-1),但在Ⅱ-Ⅳ期显著上升并保持相对稳定。E2含量峰值(180.74 pg g-1)仍出现在Ⅲ期,而V期肝胰腺中的E2含量有所降低(146.25 pg g-1)。卵巢中的E2含量在Ⅰ期最低,并在随后的时期显著上升并保持相对稳定。三种组织中的E2含量变化都遵循先上升再下降的规律。免疫荧光法对肝胰腺、卵巢和神经组织中的E2分布进行了探究。结果显示,卵巢中E2主要分布于卵巢发育全期的滤泡细胞以及卵母细胞胞质中;肝胰腺中E2阳性主要分布于F细胞和R细胞胞核;脑神经节的神经细胞中主要呈现出中等强度的E2阳性信号;胸神经团的E2阳性信号主要分布于神经细胞和神经髓质中。血淋巴、肝胰腺和卵巢中E2和Vg/Vn含量的相关性分析结果显示,内源性卵黄合成期血淋巴中E2和Vg/Vn含量呈现线性正相关关系（R2>0.8）;在外源性卵黄合成期的血淋巴中,E2和Vg/Vn含量则呈现非线性负相关关系（R2>0.8）;外源性卵黄合成期肝胰腺中,E2和Vg/Vn含量同样表现出高度相关的非线性负相关关系（R2>0.8）;Ⅱ-Ⅳ期卵巢中的E2和Vg/Vn含量呈非线性负相关关系,属于显著相关关系（0.6<R2<0.8）。免疫荧光共定位被用于探究中华绒螯蟹不同卵黄合成期的肝胰腺和卵巢中E2和Vg/Vn分布的潜在关联。就肝胰腺而言,在内源性合成期E2和Vg/Vn的阳性信号主要在F细胞胞质和R细胞胞质重叠,而在外源性合成期两者的重合位点主要为R细胞核以及少量F细胞胞质;就卵巢而言,在卵黄合成前期和内源性卵黄合成期,E2主要存在于滤泡细胞,而Vg/Vn蛋白主要分布于内源性卵黄合成期卵母细胞胞质,两者的空间分布并无直接联系;在外源性合成期,滤泡细胞逐渐无法观测,E2和Vg/Vn阳性信号也仅同时在卵母细胞胞质出现。以上结果表明,卵黄发生早期中华绒螯蟹中E2和Vg/Vn在含量和分布上有一定相关性,但这种关联随着卵巢发育至成熟期而逐渐减弱。3.17β雌二醇和20羟基蜕皮酮对中华绒螯蟹卵黄蛋白原及其受体基因的表达调控体外组织培养结果表明,在内、外源性卵黄合成期的肝胰腺和卵巢中,使用0.01μM E2培养24 h后,组织中的Vg-mRNA表达量均有显著提高。E2活体注射实验结果也显示,一定剂量的E2能够提高Vg-mRNA的表达。本实验中,20E在离体和在体条件下也能够对肝胰腺和卵巢中的Vg-mRNA表达起到一定调控作用,其中0.1μM 20E具有更显著的调控效果。但是与E2相比,20E在卵巢中的诱导效果并不明显。添加0.1μM 20E培养24 h后,内源性合成期的肝胰腺和卵巢组织中的Vg-mRNA表达量显著上升,而外源性合成期的Vg-mRNA表达量则无显著变化。20E活体注射实验结果同离体实验结果类似,0.2μg g-1 20E注射后24 h能够诱导肝胰腺中Vg-mRNA的表达,但是卵巢中的表达量并无显著变化。对于Vg R基因,离体条件下内源性卵黄合成期的卵巢在添加E2和20E后,都会引起Vg R-mRNA表达的显著下调。以上结果表明,类固醇激素能够调控Vg基因的表达,但类固醇激素可能通过影响VgR等其他卵黄发生相关基因共同协调卵黄发生过程。4.17β雌二醇和20羟基蜕皮酮对中华绒螯蟹卵黄蛋白原基因表达调控机制探索本研究首先克隆了中华绒螯蟹雌激素相关受体基因（Estrogen related receptor,ERR）。该基因全长2825 bp,共编码423个氨基酸,无信号肽及跨膜结构域,氨基酸序列与三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）ERR序列同一性和相似性均高达97.2%。ERR的时空表达分析结果显示,ERR在中华绒螯蟹肌肉组织中表达量最高,在肝胰腺和卵巢等组织中也有表达;就不同卵巢发育时期而言,肝胰腺中ERR的相对表达量在Ⅲ期显著最低,但在其它时期较稳定,而在卵巢中,ERR表达量在卵巢发育过程呈现总体上升的趋势,尤其在Ⅲ-Ⅳ期时发生了显著的上升。EcR在不同卵巢发育期的表达分析结果显示,肝胰腺EcR的表达在Ⅳ期出现显著上升,其它四个时期表达量无显著差异;卵巢EcR的表达则在Ⅲ-Ⅳ期较高,而在V期时显著下调。对ERR和EcR的离体干扰实验表明,ERR和EcR的敲降均可导致Vg-mRNA表达的显著下调;在添加外源性激素的情况下,ERR和EcR的敲降还能够消弭E2和20E对Vg-mRNA表达的促进作用,表明ERR和EcR可能协同参与类固醇激素对中华绒螯蟹卵黄发生的调控作用。E2和ERR重组蛋白的结合力试验表明,E2无法与ERR重组蛋白直接结合。本研究采用DNA步移法克隆得到了中华绒螯蟹Vg 5’非编码区上游1717 bp的序列,并分析了其中的转录起始位点和核心启动子序列,同时在该序列上发现了潜在的1/2雌激素应答元件（1/2 ERE）序列,推测雌激素可能通过核受体与Vg启动子上的转录调控元件相互作用发挥其功能。