研究背景近年来关于皮肤菌群的研究逐渐成为皮肤研究领域新的热点。位于皮肤表面的细菌、病毒和真菌与宿主细胞相互作用,对于维持皮肤的生理功能具有重要的意义,并参与了多种皮肤疾病的发生。皮肤菌群对皮肤免疫系统的形成及维持具有重要的作用。动物实验研究结果显示,皮肤菌群可以影响皮肤内T细胞的数量及分布,促进抗炎性因子的释放,增强对致病细菌感染的免疫;另一方面,皮肤菌群可以增加皮肤局部引流淋巴结Treg的数量,增强皮肤的免疫耐受。综上所述,皮肤菌群发挥了维持皮肤的免疫应答和免疫耐受之间的平衡作用,但其中的具体内在机制仍然不是很清楚。我们前期的研究结果显示,利用广谱抗生素涂抹小鼠,使小鼠皮肤菌群减少,再用致敏剂对其进行刺激,观察不同处理组小鼠皮肤接触性超敏反应差异,发现菌群减少后小鼠的超敏反应明显增强,提示皮肤菌群可能参与皮肤免疫应答的调控,其具体机制仍待进一步研究。Langerhans细胞(LCs)是皮肤最外层定居的树突状细胞,能够对抗原进行识别、摄取、加工、提呈,成熟活化后逐渐向局部引流淋巴结迁移,在局部引流淋巴结活化T细胞,介导对抗原的免疫应答。近些年来发现LCs在皮肤中对一些抗原发挥了的免疫耐受作用,逐渐认识到LCs的负向免疫调控作用对于机体自身十分重要。研究发现LCs在皮肤引流淋巴结可以诱导皮肤中的Treg细胞产生IL-10,发挥免疫抑制作用。然而,在皮肤菌群介导的免疫应答中LCs所发挥的具体作用至今尚不明确,仍需进一步研究。研究表明由于LCs表面不表达识别细菌所需的TLR2、4、5,因此不能识别胞外细菌,进而不能对细菌产生相关免疫。但是,近些年研究中逐渐认识到LCs可以通过其特征性表达的C型凝集素受体CD207来识别包括人类免疫缺陷病毒(Human Inmmunoldeficiency Virus,HIV)、麻疹病毒、分枝杆菌、真菌,但是CD207能否在皮肤常驻菌群的识别中发挥作用尚不明确。研究目的进一步明确皮肤菌群在接触性超敏反应中的作用;明确LCs在介导皮肤菌群在调控接触性超敏反应中的作用及机制;揭示LCs表面特征性受体CD207在LCs调控免疫中发挥的作用及机制。研究方法1.取野生型C57BL/6小鼠15只,随机分为基质组、莫匹罗星组和表皮葡萄球菌组,各组5只,背部剃毛后,基质组涂抹乳胶基质作为阴性对照,莫匹罗星组涂抹莫匹罗星建立菌群减少模型,表皮葡萄球菌组先涂抹莫匹罗星建立菌群减少模型再添加表皮葡萄球菌(Staphylococcus Epidermidis,SE)进行菌群挽救,三组小鼠再进行恶唑酮致敏、激发,观察皮肤菌群改变对小鼠接触性超敏反应(Contact Hypersensitivity,CHS)的影响。2.利用CD207-DTA转基因小鼠(LCs组成性缺失)和野生型C57BL/6小鼠各5只,剃毛后分别涂抹乳胶基质或莫匹罗星建立菌群减少模型,两组小鼠再进行恶唑酮致敏、激发,观察表皮LCs缺失时皮肤菌群改变对CHS反应的影响。3.将小鼠CD207质粒转染入HEK293T细胞,与CTC染色的SE共孵育;SE与重组小鼠CD207蛋白孵育,观察小鼠CD207分子对SE的结合。4.取野生型C57BL/6小鼠15只,随机分为基质组、莫匹罗星组和表皮葡萄球菌组,各组5只,背部剃毛后,莫匹罗星组涂抹莫匹罗星建立菌群减少模型,表皮葡萄球菌组先涂抹莫匹罗星建立菌群减少模型再添加SE进行菌群挽救,三组小鼠再进行恶唑酮致敏、激发,观察在CHS反应中LCs的迁移及活化分子CD80/86/273/274和皮肤局部IL-1、IL-6、IFN-γ、TNF-α、Rank L的表达,及添加菌后IL-10的分泌。5.取野生型C57BL/6小鼠及CD207-DTA小鼠各5只,背部胶带粘贴,造成皮肤屏障轻度破坏,添加SE,HE切片观察与相同处理的野生型小鼠相比,表皮厚度的改变。研究结果1.皮肤菌群抑制接触性超敏反应:野生型小鼠涂抹莫匹罗星后制备CHS模型,小鼠耳厚测量及组织HE切片显示皮肤炎症显著重于未涂抹莫匹罗星的对照小鼠;而在菌群减少后外用SE,发现添加SE的小鼠皮肤炎症明显减轻,提示皮肤菌群对CHS应答具有抑制作用。2.LCs介导了皮肤菌群对CHS反应的调控:利用CD207-DTA小鼠制备CHS模型,发现外用莫匹罗星导致的菌群改变对CHS反应的影响消失,提示LCs介导了皮肤菌群对皮肤CHS应答的调控。3.CD207分子可以结合SE:转染了小鼠CD207质粒的HEK293T细胞与CTC染色的SE共孵育,激光共聚焦发现两者共定位,部分SE结合在CD207阳性的细胞膜上。以SE为载体,将SE与重组的小鼠CD207蛋白共孵育,发现CD207蛋白可以结合在SE上。4.LCs及皮肤菌群调控免疫应答的机制:利用野生型小鼠制备CHS模型,发现在皮肤菌群减少时皮肤引流淋巴结中LC细胞表达CD80、CD86、CD273、CD274的水平均高于菌群正常对照小鼠,皮损局部IL-1、IL-6等炎症相关因子的表达也高于对照小鼠。添加表皮葡萄球菌后,LC细胞表面的CD80、CD86、CD273、CD274及皮肤局部IL-1、IL-6等炎症相关因子的表达均降低,添加菌后LCs分泌IL-10的能力增强。5.皮肤屏障破坏后LCs促进皮肤炎症:利用CD207-DTA小鼠,剃毛后以胶带粘贴小鼠皮肤,SE涂抹1周,发现CD207-DTA组小鼠的表皮增厚显著弱于野生型小鼠。研究结论通过以上研究,我们在皮肤菌群减少模型和菌群挽救模型中发现皮肤菌群可以调控CHS炎症应答,利用LC组成性缺失的CD207-DTA转基因小鼠发现LC参与了皮肤菌群的调控作用;在体外实验中发现SE可以结合CD207分子,说明LC通过CD207识别SE,另外在添加SE后流式检测发现LC分泌IL-10细胞因子的能力增强,进一步证明了LC可能在菌群调控皮肤免疫应答中发挥重要作用。当表皮屏障破坏时,皮肤的共生菌SE可以促进表皮增厚,并且LC在其中发挥作用。