【摘 要】
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非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引发并危害世界养猪业健康发展的严重烈性传染病,致死率100%。目前,世界上还没有上市的非洲猪瘟疫苗,ASFV灭活病毒疫苗已被证明不具有完全保护性,基因缺失的减毒活疫苗在攻毒中具有保护性,但安全性有待进一步验证。研发新型疫苗已成为业界急需解决的重大科技问题,因此采
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非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引发并危害世界养猪业健康发展的严重烈性传染病,致死率100%。目前,世界上还没有上市的非洲猪瘟疫苗,ASFV灭活病毒疫苗已被证明不具有完全保护性,基因缺失的减毒活疫苗在攻毒中具有保护性,但安全性有待进一步验证。研发新型疫苗已成为业界急需解决的重大科技问题,因此采用亚单位疫苗的路线进行研究。亚单位疫苗的优点在于安全、高效、可规模化生产,缺点在于激活细胞免疫水平较弱,在已知ASFV结构蛋白中,利用基因工程技术对有效区域及优势抗原表位进行改造或修饰,并通过增加分子佐剂的方法,以增强抗原在体内的持续刺激,激活体液及细胞免疫应答。本研究选择以ASFV截短的主要衣壳蛋白p72（185-405aa）和全长的五邻体蛋白H240R为研究对象,分别命名为P蛋白和H蛋白,分子量约为27 k Da和31 k Da,后利用基因工程手段,在截短的p72蛋白C端通过柔性连接子连接分子内佐剂tuftsin和破伤风毒素T细胞表位P2,为P-T蛋白,分子量约为35k Da。目的蛋白经原核表达及亲和层析纯化,结果表明,制备的P-T蛋白、P蛋白和H蛋白在不同诱导温度下均以包涵体蛋白形式存在,最佳表达条件为37℃,IPTG终浓度为0.5 mmol/L,转速为210 rpm。经纯化复性后三种蛋白纯度均能到达90%以上,且分子量与预期结果无误。Western blot和Dot-ELISA显示高免血清可以和三种蛋白结合显色,表明复性后的蛋白具有免疫原性和活性。经Triton X-114液相萃取法除去蛋白中的内毒素后,鲎试剂检测内毒素含量均小于50 EU/m L,符合《中国兽药典》的标准要求。复性后的三种蛋白在30℃下分别与W/O/W型ISA 201 VG佐剂乳化15 min,乳化形成的免疫制剂具有较好的稳定性。免疫时的最佳注射剂量为50μg/只,在小鼠中对这些蛋白进行免疫效应评价,均能刺激机体产生免疫反应。H蛋白免疫组血清抗体水平在免疫第28 d时达到平台期,效价为1:64000,而其它几组均在免疫第35 d达到平台期,P-T免疫组血清抗体效价为1:96000,P-T+H混合免疫组血清抗体效价为1:128000,P蛋白血清抗体效价只有1:32000。P-T免疫组和P-T+H混合免疫组诱导强烈的体液免疫反应,并诱导产生了高于P和H蛋白单独免疫组的细胞因子（IL-2、IFN-γ和TNF-α）和T淋巴细胞增殖水平（P＜0.001）,表明分子佐剂能提高蛋白在机体中的体液免疫及Th1型细胞免疫应答。流式细胞术检测小鼠脾脏T淋巴细胞分化情况,结果显示P-T组和P-T+H组CD3+和CD4+T淋巴细胞比例明显增加,高于其它免疫组（P＜0.01）,但两组对比并无明显差别,证明H蛋白只能协助P-T蛋白增强机体体液免疫反应,并进一步验证了分子佐剂能促进蛋白在机体中的免疫作用。总之,本研究原核表达得到的三种重组蛋白在小鼠体内产生了良好的免疫应答,分子佐剂对蛋白的体液及细胞免疫效应均具有提升作用,H240R蛋白和p72蛋白存在互作效应,能促进p72蛋白在机体中的体液免疫能力,为疫苗的进一步研发提供了思路。
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