【摘 要】
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该实验应用随机鸟枪法,将Xoo的基因组DNA用超声波破碎的方法随机断裂为大小分布在1.6-3 Kb之间的DNA小片段,然后将目的片段和载体UC18/SmaI/BAP连接,取2μ1连接产物进行电转
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该实验应用随机鸟枪法,将Xoo的基因组DNA用超声波破碎的方法随机断裂为大小分布在1.6-3 Kb之间的DNA小片段,然后将目的片段和载体<,p>UC18/SmaI/BAP连接,取2μ1连接产物进行电转化,获得了一套小片段的Xoo基因文库,从文库中随机挑选48个白斑克隆,PCR扩增结果表明,插入片段多数在1.6-3Kb之间,插入率在95﹪以上,符合大规律测序的要求.用Sau3AI部分酶切Xoo基因组DNA,使其多数分布在23-48Kb之间,然后再与粘粒载体Supercos1/Xbal/CIP/BamH连接、体外包装和转导,获得了大片段的Xoo基因组文库,随机挑选17个克隆进行EcoRI酶切,其中未见一个空载体,而且每个克隆的酶切条带均不相同,表明此文库的代表性良好.这两套文库将为研究Xoo的结构基因组学奠定了坚实的基础.通过建立了由E.coli-Tn5到Xoo-Tn5的转化体系,构建了Xoo-Tn5的突变体库,使基库容量达到了饱和状态,并对Xoo-Tn5进行了卡那霉素抗性检测、PCR检测和基因组的Southern blot检测,结果均表明,Tn5确实插入到了Xoo的基因组中,通过观察比较黄原胶的产量,获得了若干有表型的Xoo-Tn5突变体.然后不断摸索和优化Tail-PCR的条件,用Tail-PCR的方法来分离、克隆与产生黄原胶及致病相关的基因,再通过构建好的Xoo基因文库,获得全长、完整的基因.
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