第一部分 肝癌浸润性CD8~+T细胞耗竭特点及机制研究背景:肿瘤微环境中免疫失衡,是肿瘤的重要特征之一。由免疫细胞介导的适应性免疫反应,在肿瘤发生发展中扮演着极为重要的角色。CD8~+T细胞是最主要的抗肿瘤效应细胞。CD8~+T细胞浸润到肿瘤组织后,在肿瘤抗原的慢性持续刺激下,逐渐发展至功能紊乱的耗竭状态。T细胞耗竭,是抗肿瘤效应减弱的重要机制之一。目的:本研究着眼于肿瘤免疫抑制环境中CD8~+T细胞耗竭,深入探讨肝癌中T细胞耗竭特点,为进一步机制研究及寻找潜在的肝癌特异性T细胞耗竭决定基因,开发肝癌临床干预新治疗方法提供支持。方法:收集HCC患者(慢性HBV感染)新鲜肿瘤组织与癌旁组织,制备成单个细胞悬液。收集HCC患者及正常人外周血。利用Percoll梯度离心法,分离获得肿瘤浸润性淋巴细胞(Tumor infiltrating Lymphcyte,TIL)及外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear cyte,PBMC)。流式细胞术,检测CD8~+T细胞的增殖能力(Ki67)、凋亡水平(A-caspase-3)、产生效应细胞因子的能力(IFN-γ,TNF-α,IL-2),以及抑制性受体(免疫检查点分子PD1,TIM3,CTLA4,LAG3)的表达水平。根据细胞表面PD1、TIM3的表达,流式分选非耗竭与耗竭的肝癌浸润性CD8~+T细胞,转录组测序,分析测序结果,获得CD8~+T细胞耗竭相关基因。生物信息学分析肝癌浸润性CD8~+T细胞耗竭的特点。获取GEO数据库中,HBV相关HCC浸润性CD8~+T细胞的单细胞测序结果,分析慢性HBV感染非肝癌组织浸润CD8~+T细胞与慢性HBV感染肝癌组织浸润CD8~+T细胞耗竭的异同。结果:慢性HBV感染肝癌患者新鲜肿瘤组织与癌旁组织浸润的CD8~+T细胞处于功能耗竭状态,抑制性分子表达升高(PD1、TIM3、CTLA4、LAG3),细胞增殖能力减弱(Ki67),凋亡水平升高(A-caspase-3),分泌效应细胞因子的(IFN-γ、TNF-α、IL-2)能力减弱。与HBV感染的非肝癌组织相比,肝癌组织浸润的CD8~+T细胞,耗竭较严重。采用Speiser.et al.提出的耗竭基因模型,对GEO数据来源的HBV感染的肝癌浸润性CD8~+T细胞与HBV感染的非肝癌组织浸润性CD8~+T细胞,基因表达特点进行分析,发现两种组织中CD8~+T细胞耗竭相关基因分别富集在不同基因模型中,提示其耗竭机制具有显著差异。转录组测序分析发现,肝癌浸润性耗竭与非耗竭CD8~+T细胞,转录组表达谱存在显著性差异。耗竭相关基因主要富集在,细胞代谢、细胞周期中的多个信号通路。耗竭CD8~+T细胞中,TCR信号通路激活程度较高,提示其功能耗竭与TCR持续过度活化有关。结论:慢性HBV感染肝癌患者肿瘤组织与癌旁组织浸润性CD8~+T细胞均存在功能耗竭现象,且两种环境中CD8~+T细胞耗竭程度及其分子机制不同。第二部分 TOX调控肝癌浸润性CD8+T细胞耗竭及其分子机制背景:CD8+T细胞耗竭,在肿瘤发生发展中扮演着重要角色。耗竭T细胞具备与初始T细胞(Tna)、效应T细胞(Teff)及记忆性T细胞(Tm)截然不同的转录过程及分子特征,其表面表达一系列免疫抑制性受体,如PD1、CTLA4、LAG3及TIM3等。T细胞耗竭,根据其程度分为可逆性的早期耗竭(T细胞表面PD1表达水平较低),和不可逆的晚期耗竭(T细胞表面PD1表达水平很高)。针对早期耗竭的T细胞,给予阻断T细胞表面抑制分子的治疗,能够从一定程度上,恢复T细胞功能[26-29]。但是这种方法,对逆转晚期耗竭T细胞的状态几乎没有作用。这可能也就是临床治疗中,很多肿瘤病人对应用PD1,CTLA4等抗体治疗不敏感的重要原因。在肿瘤发生发展过程中,T细胞耗竭的发生使抗肿瘤免疫逐渐减弱,从而使肿瘤免疫微环境变得适宜肿瘤发展。因此,研究肿瘤中T细胞耗竭现象,一方面对深入阐释免疫与肿瘤关系提供新的理念;另一方面为逆转T细胞耗竭来治疗肿瘤提供理论依据和证据支持。目的:本研究着眼于肝癌中CD8+T细胞耗竭,寻找导致肝癌浸润性CD8+T细胞耗竭的关键基因,进一步探究其功能及调控CD8+T细胞耗竭的分子机制,为开发新的HCC临床干预治疗方法提供支持。方法:收集HCC患者新鲜肿瘤组织与癌旁组织,制备单细胞悬液。收集HCC患者及正常人外周血。利用Percoll法,梯度离心法,分离获得肿瘤浸润性淋巴细胞(Tumor infiltrating Lymphcyte,TIL)及外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear cyte,PBMC)。流式细胞术,检测CD8+T细胞的增殖能力(Ki67)、凋亡水平(A-caspase-3)、产生效应细胞因子的能力(IFN-γ,TNF-α,IL-2),以及细胞表面抑制性受体(免疫检查点分子PD1,TIM3,CTLA4,LAG3)的表达水平。根据细胞表面PD1、TIM3的表达,流式分选非耗竭,部分耗竭及完全耗竭的肝癌浸润性CD8+T细胞,转录组测序,分析测序结果,获得CD8+T细胞耗竭相关基因,TOX。在急性感染、慢性感染及多种肿瘤模型中,验证耗竭性CD8+T细胞中TOX的表达。构建条件性TOX基因敲除小鼠,在T细胞中特异性敲除TOX,并采用过继T细胞转移将敲除TOX基因的CD8+T细胞经尾静脉,输注到皮下荷瘤的CD8-/-基因敲除小鼠中。观察肿瘤生长,并分析肿瘤浸润性CD8+T细胞的功能状态。利用患者肿瘤组织分离获得的肝癌细胞或人源肝癌细胞株,在免疫缺陷小鼠中构建肝癌模型(Patient derived tumor xnegraft,PDX)。通过过继T细胞转移将过表达TOX基因的人外周血来源CD8+T细胞或敲除TOX基因的肝癌浸润性CD8+T细胞,经尾静脉输注小鼠体内,同时联合或不联合使用PD1抑制剂治疗。观察肿瘤生长,并分析肿瘤浸润性CD8+T细胞的功能状态。转录组测序,分析过表达TOX前后,CD8+T细胞转录组表达谱变化,分析TOX调控的关键信号通路,并采用western blot实验验证。实时定量PCR实验,western blot实验及流式细胞术,分析TOX对PD1表达的调控。流式细胞术验证TOX调控PD1降解及内体循环的过程。分选HCC患者外周血淋巴细胞,检测CD8+T细胞中TOX表达水平与肝癌浸润性CD8+T细胞耗竭的关系。结果:根据抑制性分子表达水平,将肝癌浸润CD8+T细胞分为不同的功能亚群。PD1-TIM3-为功能正常的抗肿瘤效应CD8+T细胞,PD1int TIM3+表示功能处于部分耗竭状态,PD1int TIM3+这群CD8+T细胞则完全失去了效应能力,处于严重耗竭状态。分析非耗竭,部分耗竭,严重耗竭三组CD8+T细胞的转录组表达差异,发现TOX与CD8+T细胞耗竭关系最密切,在严重耗竭CD8+T细胞中表达水平最高,在非耗竭CD8+T细胞中几乎不表达。TOX在LCMV慢性感染模型CD8+T细胞中表达水平上调,而在急性感染模型中表达水平没有改变。在多种肿瘤模型中也发现,肿瘤浸润性CD8+T细胞中TOX表达也升高。并且耗竭性CD8+细胞中TOX表达显著高于非耗竭的CD8+T细胞。在DEN诱导的自发性肝癌模型中也发现,TOX在耗竭性CD8+T细胞中表达升高。OT-1小鼠来源的CD8+T细胞过继转移的荷瘤小鼠中,肿瘤浸润性CD8+T细胞中TOX表达没有升高。将野生小鼠,Tox L/+Cd4Cre,Tox L/LCd4Cre小鼠的CD8+T细胞过继转移到皮下荷瘤的CD8-/-小鼠中,结果发现,与野生对照小鼠相比,在TOX部分敲除的小鼠中,肿瘤生长受到了抑制,然而在TOX完敲除小鼠中,肿瘤生长加快。流式检测分析发现TOX减少,改善了耗竭性T细胞的功能。TOX部分敲除组,肿瘤内浸润的CD8+T细胞显著增多,而TOX完全敲除组,肿瘤内浸润的CD8+T细胞数量减少。TOX部分敲除促进肿瘤浸润CD8+T细胞的增殖能力,减弱其凋亡;而TOX敲除则相反。PDX小鼠模型中,敲低TOX的CD8+T细胞,显著延缓了肿瘤的生长,并且联合PD1抑制治疗时,呈现更好的抗肿瘤效果。流式分析发现,敲低TOX增加了CD8+T细胞的增殖能力以及产生效细胞因子的能力,减少了其凋亡,并且对PD1抑制剂更加敏感。TOX敲低的CD8+T细胞,更多地浸润到肿瘤内。过表达TOX,小鼠肿瘤生长加快,并且过表达TOX导致肿瘤浸润CD8+T细胞对PD1抑制剂不反应。过表达TOX,T细胞活化相关的基因呈现显著上调。TOX高表达导致了PD1相关信号通路的活化,以及PI3K信号通路的抑制。TOX相关基因富集在RAS,PI3K等信号通路中。干预TOX表达,PD1在蛋白水平上相应改变,而m RNA水平没有变化。应用蛋白酶体抑制剂,MG132没有逆转TOX敲低引起的PD1减少。应用溶酶体抑制剂,氯喹和Baf A1,上调了TOX敲低的CD8+T细胞中PD1的水平。溶酶体抑制剂,能够上调TOX敲低的CD8+T细胞中PD1的表达,但是其细胞膜上的PD1水平却没有增加。内吞实验,观察到TOX敲低的CD8+T细胞中,细胞膜PD1降低速度加快。通过染色发现,在循环内体中能够检测到PD1。应用内体循环抑制剂,发现CD8+T细胞膜表面PD1减少,证实内体循环过程参与调控PD1膜转运。内体循环实验发现,TOX敲低使PD1膜转运减少。TOX高表达的CD8+T细胞,PD1水平较高,并且PD1+TIM3+细胞比例较高。外周血CD8+T细胞与肿瘤浸润CD8+T细胞中TOX表达水平呈正相关,外周血中CD8+T细胞高表达TOX的患者其肿瘤浸润CD8+T细胞耗竭比例较高,肿瘤内浸润的CD8+T细胞数量较少。结论:TOX高表达促进了肝癌浸润性CD8+T细胞耗竭。高表达TOX抑制了CD8+T细胞的抗肿瘤能力,减弱了其对PD1抑制剂的反应性;反之,降低TOX表达,能改善CD8+T细胞抗肿瘤效应,增加PD1抑制剂的治疗效果。在肝癌浸润CD8+T细胞中,TOX促进PD1经循环内体转运至细胞膜,减少溶酶体途径的降解,从而提高CD8+T细胞中PD1在膜上的水平。肝癌患者外周血中CD8+T细胞TOX的表达,可以用于反应患者肿瘤的组织学特点及组织内的免疫状况。