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胶质母细胞瘤（GBM）是最常见的中枢神经系统（CNS）恶性肿瘤,因其发展迅速,诊断差以及复发快而严重威胁人类健康。血脑屏障（BBB）主要由毛细血管内皮细胞及其紧密连接组成,是一种高度选择性的渗透屏障,可将循环血液与CNS中的细胞外液分开。因此,血脑屏障成为脑部治疗药物输送的实质性障碍,导致传统的化学疗法不能有效地将药物传递到大脑。纳米药物的发展具有改善CNS疾病治疗效果的潜力,尤其是在神经胶质瘤的诊断和治疗中。细胞膜仿生修饰是一种新型纳米粒仿生方法。许多研究证明细胞膜仿生修饰纳米粒不仅保留了天然细胞膜的复杂生物学功能,同时具有适合有效药物传递的理化特性。与传统的合成纳米药物递送系统相比,细胞膜修饰后的纳米粒可以延长血液循环时间并显示出较低的免疫原性以及肿瘤靶向性。如果对细胞进行工程化改造,使细胞拥有某种特性,则有可能进一步提高细胞膜仿生修饰纳米粒在肿瘤治疗中的作用。程序性死亡受体-1（PD-1）是通过抗原刺激在T细胞上诱导表达的共抑制性受体。当PD-1与程序性死亡配体-L1（PD-L1）结合时,T细胞效应功能被抑制,肿瘤免疫逃避作用增强。在GBM中PD-1和PD-L1相互作用,形成一个免疫调节轴。GBM表达高水平PD-L1促进小胶质细胞中PD-1受体激活,从而负调控T细胞反应,增强GBM在脑组织中的侵袭作用。GBM小鼠模型研究证实PD-1或PD-L1单克隆抗体可以显著消退肿瘤和延长小鼠存活时间,说明阻断PD-1和PD-L1的相互作用能够重新建立针对GBM的抗肿瘤免疫力。基于此,我们猜想可以从PD-1/PD-L1免疫检查点入手通过免疫检查点阻断联合化疗的方式对GBM进行治疗。首先我们将PD-1基因稳定转入巨噬细胞中,构建了PD-1高表达的工程化巨噬细胞株。并利用该高表达PD-1的巨噬细胞膜修饰负载雷帕霉素（RAPA）的PLGA纳米粒,构建具有免疫治疗功能的纳米药物PD-1-MM@PLGA/RAPA。接下来探究了PD-1-MM@PLGA透过BBB以及对PD-L1的靶向能力。并通过胶质瘤原位移植模型评价了PD-1-MM@PLGA/RAPA的抗肿瘤作用以及调控免疫微环境增强抗肿瘤效应的能力。本课题主要研究内容和结果如下:（1）PD-1高表达的工程化巨噬细胞株（Raw264.7-PD-1）的构建及表征:通过慢病毒载体转染的方式构建PD-1高表达的工程化巨噬细胞株,实时荧光定量PCR结果显示相对于未转染巨噬细胞株,该稳转株PD-1 m RNA水平提高了173倍;免疫荧光和流式细胞术检测均显示该稳转株高表达PD-1蛋白。（2）PD-1-MM@PLGA/RAPA的制备和表征:将PLGA作为载体并通过纳米沉淀法制备装载RAPA的纳米药物PLGA/RAPA,进一步采用共挤出的方式制备纳米药物PD-1-MM@PLGA/RAPA,随后对其进行一系列表征。结果表明我们成功制备了细胞膜仿生修饰的PD-1-MM@PLGA/RAPA;且PD-1-MM@PLGA/RAPA粒径均一、分散性良好,具有典型的“核-壳”结构和较好的稳定性;此外,PD-1-MM@PLGA/RAPA较好地保留了Raw264.7-PD-1细胞的膜蛋白以及特征性功能蛋白（CD11c、F4/80、CD206、PD-1）。（3）PD-1-MM@PLGA体内外透BBB评价:体外Transwell模型探究结果表明在Transwell模型中PD-1-MM@PLGA/Di I、MM@PLGA/Di I均可被下室C6细胞吸收,说明D-1-MM@PLGA/Di I、MM@PLGA/Di I都可透过BBB。另一方面小动物实体成像结果显示,PD-1-MM@PLGA/Di R能够透过体内BBB并在小鼠脑部GBM区域靶向聚集;且脑组织离体成像进一步表明PD-1-MM@PLGA/Di R主要积累于GBM中PD-L1高表达区域,说明PD-1-MM@PLGA/RAPA可以在体内透过BBB并靶向GBM。（4）PD-1-MM@PLGA体内外PD-L1靶向评价:细胞摄取结果显示,PD-1-MM@PLGA/Di I易被细胞吸收,但PD-L1阳性C6细胞对其的吸收能力显著性升高,说明PD-1-MM@PLGA/Di I可以靶向PD-L1;另外CCK-8检测结果显示,PD-1-MM@PLGA/RAPA对PD-L1阳性C6细胞（37.54%）的抑制率明显高于PD-L1阴性4T1细胞（22.42%）,而MM@PLGA/RAPA对4T1（24.21%）和C6（27.38%）细胞的抑制率无明显差异,进一步说明PD-1-MM@PLGA/RAPA可以靶向PD-L1。同时体内实验结果表明相比于MM@PLGA/RAPA、PLGA/RAPA和Glucose,PD-1-MM@PLGA/RAPA可以明显抑制皮下GBM生长,肿瘤组织中细胞因子IFN-γ、TNF-α表达水平也明显增多,且C6肿瘤组织中浸润的CD45+CD8+T细胞多于4T1肿瘤,说明PD-1-MM@PLGA/RAPA可以在体内靶向PD-L1,并显示出调控免疫微环境的能力。（5）体内药效学实验以及调控免疫微环境增强抗肿瘤效应:体内实验结果表明PD-1-MM@PLGA/RAPA处理后,荷瘤小鼠脑部C6-Luc细胞荧光强度相比于Glucose组,PLGA/RAPA组和MM@PLGA/RAPA组明显降低,说明其可显著抑制脑肿瘤生长。生存曲线也表明PD-1-MM@PLGA/RAPA组小鼠的存活时间（中位生存时间:29天）显著高于对照组。脑部切片的H＆E染色结果显示PD-1-MM@PLGA/RAPA组胶质瘤细胞排列稀疏,同时免疫组化结果显示,PD-1-MM@PLGA/RAPA组中神经胶质纤维酸蛋白（GFAP）的表达高于Glucose组、PLGA/RAPA组和MM@PLGA/RAPA组,而Ki-67的表达相对较低,说明PD-1-MM@PLGA/RAPA能有效抑制肿瘤细胞的恶性增殖,延缓胶质瘤恶性发展。同时流式细胞术和ELISA检测显示PD-1-MM@PLGA/RAPA组肿瘤浸润CD45+CD8+T细胞显著性升高,肿瘤组织分泌的细胞因子TNF-α和IFN-γ也显著性升高,说明PD-1-MM@PLGA/RAPA能调控免疫微环境,增强T细胞活性改善抗肿瘤效应。总之在本研究中我们成功制备了PD-1高表达巨噬细胞株,接下来制备了细胞膜仿生修饰的纳米药物PD-1-MM@PLGA/RAPA,并且该PD-1-MM@PLGA/RAPA能够高效的包裹抗肿瘤药物RAPA,还能够保留Raw264.7-PD-1细胞的膜蛋白,同时PD-1-MM@PLGA具有透过BBB的能力以及PD-L1靶向能力。最后体内研究证明PD-1-MM@PLGA/RAPA能有效抑制脑肿瘤生长,还能调控免疫微环境,增强T细胞活性改善抗肿瘤效应。本研究有助于为脑胶质瘤的非侵入性靶向药物递送提供新选择,也为基于PD-1/PD-L1信号通路探索免疫治疗提供实验数据和理论依据。