腺苷酸环化酶 3（AC3）基因突变引起的肥胖，是迄今为止发现的第一个单基因肥胖疾病。尽管大量的基因组关联分析数据证明，人类AC3上存在多个与肥胖相关的SNP，但这些SNP位点是否对AC3的表达及功能有所贡献尚未探明。CRISPR/Cas9技术可以进行单碱基编辑，因此本文在对人类AC3基因肥胖相关SNP位点进行生物信息学分析的基础上，以293T细胞为主要实验材料，利用CRISPR/Cas9技术对AC3基因上肥胖相关SNP位点进行编辑，探究SNP位点对AC3基因表达的影响及其机制：
　　1、对人类AC3基因肥胖相关SNP位点进行生物信息学分析：1）对蛋白的翻译后修饰位点以及3’UTR上miRNA结合位点进行预测分析，发现仅在exon1和exon17上的SNP位点可能发生磷酸化，且3’UTR上的SNP位点无miRNA结合；2）预测基因上SNP位点的转录因子结合情况，发现可能与EMX家族，OTX家族，KLF家族等转录因子结合，为研究SNP调控AC3表达的机制奠定基础。
　　2、为研究exon13 SNP（rs2289092），exon17 SNP（rs1127568），3’UTR SNP（rs1044040）和intron1 SNP（rs6545814）等位点对AC3表达的影响：1）首先对SNP位点所在序列进行敲除，探究SNP位点所在序列在AC3表达中的作用。通过构建分别靶向以上四个SNP位点所在序列的Cas9-sgRNA质粒，转染至293T细胞中，根据靶序列产生的indels （%），筛选最佳gRNA。利用最佳gRNA对靶序列进行敲除后检测AC3的表达量，发现敲除exon13或exon17 SNP位点靶序列后AC3表达量降低；2）为进一步明确SNP位点单个碱基突变对AC3表达的影响，通过构建同源重组质粒:Cas9（D10A）-sgRNA质粒和含exon13-SNP位点同源臂的Donor-HR质粒，转染至293T细胞，构建点突变exon13 SNP的稳转细胞系，检测AC3的表达情况，结果显示点突变后AC3表达量几乎不发生改变。
　　3、为初步探究转录因子与SNP位点的差异性结合调控AC3表达的机制，本实验构建了含有野生型exon13或点突变exon13的双荧光素酶报告质粒，分别与转录因子EMX2和OTX1共转染至293T细胞，48 h后利用报告基因检测系统检测荧光素信号，以探究转录因子EMX2和OTX1与exon13-SNP位点的结合情况，结果显示EMX2与碱基为T的序列的结合力强于G，OTX1与碱基为T的序列结合，与碱基为G的序列几乎没有结合。随后将EMX2和OTX1分别与野生鼠源AC3和exon13 SNP点突变鼠源AC3共转染至293T细胞，发现与EMX2共转染后野生鼠源AC3表达量显著降低，为在小鼠活体验证EMX2调控AC3表达奠定基础。
　　结论：
　　1、经生物信息学分析，仅在AC3基因exon1和exon17的SNP位点处可能发生磷酸化修饰；AC3基因肥胖相关SNP位点可能与EMX家族，OTX家族，KLF家族等转录因子结合。
　　2、AC3基因exon13上的SNP位点突变后对AC3的表达没有影响。
　　3、转录因子EMX2可能通过与exon13 SNP位点的序列依赖性结合，进而调控AC3表达。