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实验背景:化学药物治疗是肿瘤治疗的重要方法之一,而多药耐药是导致化疗失败的主要原因。慢性髓细胞性白血病由于其基因组的不稳定性及其他原因,最终导致化疗耐受性的提高。吖啶类化合物由于其结构特性,可以与双链DNA发生反应,因此已经广泛用于多种适应症。近年来,吖啶类衍生物在肿瘤治疗上的应用研究日益增多。实验目的:本文对吖啶类化合物A23抗人白血病多药耐药细胞K562/ADM活性进行评价,并对其机制进行了研究。实验方法:采用MTT法实验检测K562/ADM细胞耐药倍数,检测A23对K562/ADM细胞增殖的影响以及3-MA、NAC、GSH对A23抑制的K562/ADM细胞增殖的影响。采用倒置显微镜观察以及Hoechst 33342荧光染色法观察A23对K562/ADM细胞明场下形态学方面的影响及暗场下细胞核的形态学影响。采用流式细胞术检测FITC Annexin V/PI、Rh 123、MDC、Lyso-Tracker Red荧光染色下,A23对K562/ADM细胞凋亡、线粒体膜电位、自噬方面的影响。采用流式细胞术检测FITC Annexin V/PI、MDC、Lyso-Tracker Red荧光染色下,3-MA、NAC、GSH对A23诱导的K562/ADM细胞自噬和凋亡的影响。采用高内涵活细胞成像系统检测Rh 123/Hoechst 33342,MDC、Lyso-Tracker Red/Hoechst 33342、DCFH-DA/Hoechst 33342、DHE/Hoechst 33342荧光染色下,A23对K562/ADM细胞P-gp功能、自噬和活性氧方面的影响。采用高内涵活细胞成像系统检测DCFH-DA/Hoechst 33342、DHE/Hoechst 33342荧光染色下,3-MA、NAC、GSH对A23诱导的K562/ADM细胞活性氧水平升高的影响。采用Western blotting检测A23对K562/ADM细胞自噬相关蛋白(ATG5、ATG7、Beclin-1、LC3)、凋亡相关蛋白(Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2、XIAP)、细胞色素c的影响以及3-MA、NAC、GSH对A23引起的上述蛋白变化的影响。实验结果:1、K562/ADM细胞具有良好的耐药性。A23对K562/ADM细胞具有明显的生长抑制作用,呈时间-剂量依赖性。A23并未对K562/ADM细胞P-gp的功能产生影响。2、A23促使K562/ADM细胞出现凋亡小体,细胞核固缩、碎裂,线粒体膜电位明显降低。A23诱导K562/ADM细胞发生凋亡,凋亡相关蛋白表达发生变化,呈时间-剂量依赖性。3、A23促使K562/ADM细胞发生自噬,与自噬相关的蛋白表达发生改变,呈时间-剂量依赖性。抑制自噬后,凋亡比率降低,凋亡促进蛋白表达降低,凋亡抑制蛋白表达升高。即A23诱导K562/ADM细胞产生的自噬对于凋亡起促进作用。4、A23促使K562/ADM细胞中活性氧水平升高,呈剂量依赖性。抗氧化剂清除活性氧后,凋亡比率降低,促凋亡蛋白表达降低,凋亡抑制蛋白表达升高。即活性氧对于凋亡起促进作用。5、A23诱导K562/ADM细胞产生的活性氧被清除后,自噬比率降低,自噬相关蛋白表达降低。即活性氧对于自噬起促进作用。6、A23诱导K562/ADM细胞发生的自噬被抑制后,活性氧水平降低。即自噬对活性氧的产生起促进作用。实验结论:吖啶类化合物A23对多药耐药细胞系K562/ADM具有明显的细胞毒性作用,这是通过促进细胞内活性氧水平的升高,进而诱导细胞发生自噬和凋亡,最终导致细胞死亡,而发挥其抗多药耐药的作用。