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新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的毒力由多个基因共同调控,这些基因主要包括F、HN、L和NP基因。本研究首先以基因VII型NDV F蛋白作为研究对象,对F蛋白的保守序列457-461位氨基酸进行单点突变,获得不同的突变体蛋白。研究发现,突变体F蛋白与野生型F蛋白均可定位在细胞表面。除N460位点以外的其余4个F蛋白突变体在同型HN蛋白的协同作用下,可以显著地增强细胞融合能力,表现为合胞体数量的增多和融合面积的扩大;此外,单独转染F蛋白突变体质粒,发现T458位和G459位氨基酸的突变,可以不依赖于HN蛋白独立诱导膜融合。通过反向遗传操作技术,成功拯救了5株突变病毒,分别是rNDV-V457D、rNDV-T458D、rNDV-G459D、rNDV-N460D和rNDV-L461D,且获救的毒株可稳定传代。NDV F基因突变病毒在DF-1细胞上的增殖速度和最高滴度均低于rNDV;其中,rNDV-T458D、rNDV-L461D与rNDV相比,在感染24h时病毒滴度具有显著差异(p<0.05);在感染40h和48h时,rNDV-T458D和rNDV-G459D与rNDV相比均具有极显著差异(p<0.01),并且rNDV-T458D和rNDV-G459D的病毒毒力由强毒变为中等毒力。此外,上述NDV F基因突变株感染SPF鸡后分别检测病毒在脏器和拭子中的含量,发现各突变株在不同组织样品中的病毒滴度均低于rNDV,rNDV呈现全身性高病毒滴度分布,其中在脾脏和法氏囊中病毒含量最高,小肠中也有较高的病毒滴度;而rNDV-T458D、rNDV-G459D和rNDV-L461D主要存在于免疫器官脾脏和法氏囊中;rNDV-V457D在小肠中病毒含量最高。因此,与rNDV相比,F蛋白的上述5个点突变降低了各突变株病毒在宿主体内的复制能力。L蛋白是NDV中最大的结构蛋白,它除了具有5’端加帽、帽依赖的甲基化转移酶活性及3’端添加多聚腺苷酸尾巴功能以外,还参与病毒基因组的转录和复制,与病毒的毒力紧密相关。对L蛋白的保守结构域K-D-K-E进行突变,成功获救了4株NDV L蛋白突变株,其病毒毒力显著减弱,由强毒株均突变为弱毒株,且突变病毒在DF-1细胞中的增殖能力低于rNDV。同时,将这4株病毒连续传至15代,测序结果证明突变位点依然存在,可以稳定遗传。突变弱毒株免疫SPF鸡21d后用基因VII型强毒NDV-74株攻毒,均可完全保护,其中rNDV-E1954Q组攻毒后,未检测到病毒排毒。在此突变毒株的基础上,构建了F蛋白突变的重组病毒rNDV-F+E1954Q,该重组病毒的毒力显著低于野生型NDV,免疫SPF鸡21d后攻毒,亦可完全保护。攻毒后检测排毒情况和脏器中病毒含量,发现各脏器中病毒载量及排毒量均低于LaSota免疫组。此外,本研究缺失NP蛋白抗原表位的18个氨基酸和突变F蛋白裂解位点,构建基因VII型NDV负标记株,获救的病毒具有毒力低、滴度高和免疫原性好等优点。免疫SPF鸡21d后攻毒,可完全保护,且排毒量和脏器病毒载量均低于LaSota对照组。本研究的结果为NDV新型疫苗的研制积累了原始数据,提供了理论支撑。