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研究背景越来越多的研究显示，肝脏在慢性炎症性损伤之后继发肝纤维化，而炎症反应在肝纤维化形成与发展过程中起着非常重要的作用。酒精、病原微生物以及其它相关炎性反应物也能激活机体免疫系统诱发炎症反应进而导致肝纤维化的形成。在肝脏炎症反应急性期与慢性期，肝细胞、内皮细胞、肝星状细胞等分泌多种细胞因子和趋化因子，诱导炎性细胞浸润于损伤部位，参与介导急性期的免疫性炎症反应和损伤组织的修复反应。Toll受体是一个能感知病原体并直接作出防御性反应的天然免疫受体。主要包括MyD88和TRIF两种主要的信号因子通路。所有的TLR适配器在介导细胞内信号转导上都具有重要的积极作用。有研究显示,肝细胞上表达一些可以被炎症或前炎性因子调节的TLRs。肝细胞表面TLR的表达在肝脏疾病的发生及其所致的肝细胞损伤中亦起着重要的作用。包括LPS与其受体TLR4结合，激活下游信号转导途径，在机体内产生一系列的免疫应答，从而促成了纤维化的发生。因此，TLRs在肝纤维化的形成过程中发挥重要的作用。但是目前的研究主要集中于上游信号，而对固有免疫下游信号因子在肝纤维化中表达的特点和规律报道很少。MyD88和TRIF作为重要信号通路，但对其表达变化的特点目前仍然不太清楚。因此，针对Toll下游重要信号因子MyD88和TRIF表达与作用特点的研究，对探讨肝纤维化的发病机制及治疗中具有重要意义。研究目的观察固有免疫信号因子MyD88在肝纤维化大鼠肝脏中的表达特点，探讨MyD88与肝纤维化发生发展的关系。研究固有免疫信号因子TRIF在肝纤维化大鼠肝脏中细胞形态学表达特点、基因和蛋白表达规律，探讨TOLL样受体下游重要的信号因子TRIF与肝纤维化发生发展的病理机制关系。方法1．造模与取材:将40只SD大鼠随机分成正常对照组（10只）和实验组（30只）。实验组大鼠给予自行配制的高脂低蛋白饲料（包含39.5%玉米面+40%面粉+20%猪油+0.5%胆固醇），同时给予实验组大鼠背部皮下注射CCl4油剂，每周2次，共计12周。第一周的2次皮下注射剂量皆为0.5ml/100g体重，以后每次注射剂量为0.3ml/100g体重，安排每周星期2和星期5进行。每天10%酒精作为唯一饮料。正常对照组大鼠正常普通饲料喂养。取材:在无菌无热源条件下，从大鼠腹主动脉采血，注入加有肝素的无热源玻璃试管中，离心取血浆置于玻璃试管中封口，低温保存。取新鲜肝左叶一部分立即固定于4%多聚甲醛，24h内进行脱水、透明、石蜡包埋；一部分置于－80℃保存。2．HE染色：肝组织石蜡切片进行常规HE染色，观察肝脏病变。3．免疫组化检测：标本常规脱蜡、梯度脱水、过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，柠檬酸热修复。山羊血清封闭(1%TritonX-100)15分钟。兔抗MyD88，按1：50稀释作为一抗，4℃过夜，HRP标记的二抗37℃孵育60分钟，PBS冲洗，DAB显色、脱水、透明、封片后镜检。4．RT-PCR法检测黑质MyD88的表达：提取大鼠肝脏总RNA，然后在42℃条件下逆转录20分钟，产物为cDNA。扩增反应，PCR产物电泳。凝胶成像仪采图，Quantityone one图像分析软件分析。5电镜标本制作与检测用10g/L戊巴比妥钠按50mg/kg腹腔注入麻醉大鼠,取出肝脏用0.1mol/L的PBS溶液冲洗,切成小的组织片，放入2%多聚甲醛-2.5%戊二醛预固定。冷缓冲液漂洗15min×3次，1%锇酸常温固定2h按照电镜常规包埋、切片，醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重电子染色，HitachiS-7500透射电镜观察。6．Western blot检测：裂解肝组织，BCA法蛋白定量，积层胶和分离胶电泳，转到硝酸纤维素膜，脱脂奶粉室温封闭，兔抗MyD88多克隆抗体4℃过夜，PBST洗后，加入辣根酶标记的山羊抗兔IgG，室温2h，化学发光检测与软件分析。7．大鼠行为学观察：在实验过程中，密切观察各组大鼠行为学的变化，判断是否有异常表现。8、统计学处理：使用SPSS17.0软件包进行数据分析，数据用x±s表示，多组间比较先进行单因素方差齐性检验，方差齐者进行方差分析，方差不齐者进行秩和检验，P<0.05表明具有统计学意义。结果1．行为学评价：正常对照组大鼠健康状况良好，精神状态佳，体重正常，饮食正常，毛质光亮。取出肝的标本可见肝面润滑红润，质地柔软；而模型组大鼠的活动量下降，饮食减少，毛质无光泽晦暗，精神不佳，体重明显下降。取出肝脏灰暗有积结，重量增加。2．免疫组化检测结果：正常组大鼠肝小叶结构排列规则有序，未见异常细胞等结构出现。在正常肝脏细胞中，肝脏实质细胞微弱表达，MyD88和TRIF的表达主要集中于一些枯否细胞、血管内皮细胞、胆管上皮细胞等非实质性肝细胞。模型组肝小叶结构明显破坏，数量明显减少，结构紊乱无序，代之以大量异常细胞浸润，纤维增生等特点。MyD88和TRIF表达明显增加，内皮细胞、星形细胞等都有强烈表达，并且以胞核表达为主，而阳性与阴性对照没有阳性表达产物出现。3．RT-PCR检测MyD88mRNA的表达：与正常对照组相比，肝纤维化组MyD88mRNA表达明显升高，差异有显著性意义（*p<0.01）。4．Western blot检测MyD88和TRIF蛋白的表达：与正常对照组相比，肝纤维化组MyD88和TRIF蛋白表达明显升高，差异有显著性意义（*p<0.01）。5．透射电镜结果检测正常对照组大鼠肝细胞胞膜完整，胞质均匀，细胞核圆且居中，核仁明显。肝窦周间隙未见纤维沉积，脂滴少见；与正常对照组相比，肝纤维化组可见高密度物质，肝细胞周围有大量胶原纤维沉积现象。窦周纤维化以及狄氏间隙扩张明显，并且可见成脂细胞；胞质可见明显的溶解现象，在狄氏腔内，肝星状细胞的细胞核溶解，血窦内皮细胞胞质、胞核皆溶解。结论1. MyD88基因和蛋白表达在肝纤维化中显著增强，在肝脏实质细胞和非实质细胞都有明显表达分布，说明MyD88可能在纤维化形成中起重要作用。2. TRIF蛋白表达在肝纤维化中显著增强，在肝脏实质细胞和非实质细胞都均有明显表达分布，说明TRIF可能在纤维化形成中起重要作用。