鳕鱼(Melanogrammus aeglefinus)被称作为“北大西洋鳕鱼”,在我国黄海和东海北部产量丰富。近年来研究发现,鳕鱼皮中含有丰富的胶原蛋白,其中的活性肽有着抗氧化、抗病毒、抗胃溃疡等功效。肝脏是机体内最重要代谢器官之一且容易受到损害,而肝病的药物治疗又会加重肝的代谢负担,所以,为肝病病人开发出安全、有效的保健食品成为肝病防治的重中之重。课题组的前期实验表明,从鳕鱼皮中提取的鳕鱼皮胶原蛋白肽(cod skin collagen peptide,CSCP)对损伤的肝细胞有较好的修复作用。鉴于此,本文以CSCP为原料,通过建立小鼠肝损伤动物模型,经灌胃给药途径,研究其对小鼠肝损伤的保护作用及其作用机制,为鳕鱼皮的开发和海洋活性物质在肝病病人保健食品上的应用研究提供了理论基础。研究内容选用小鼠急性、慢性肝损伤动物模型,以CSCP为原料并配制成不同的浓度,从以下几个方面研究CSCP对小鼠急性、慢性肝损伤的保护作用及其作用机制。1、通过灌胃给予小鼠不同浓度的CSCP,进行最大给药量急性毒性实验,确定CSCP的最大给药量。2、小鼠急性肝损伤模型的建立:实验周期为7d,前7d灌胃给予不同浓度的CSCP和阳性药物,第7d末次给药后腹腔注射0.3%浓度的CCl4花生油溶液,禁食不禁水24h后取血、取肝脏;小鼠慢性肝损伤模型的建立:实验周期为8w,每周3次腹腔注射25%浓度的CCl4花生油溶液,从第4w开始每天灌胃给予不同浓度的CSCP和阳性药物,末次灌胃给药后禁食不禁水24h后取血、取肝脏。3、小鼠肝脏损伤前后,CSCP对小鼠的日常形态、解剖前后的观察,以及在实验期间各组小鼠体重的变化。4、采用试剂盒法对小鼠血清中AST、ALT、ALP、у-GT以及肝组织匀浆中SOD、GSH-Px、CAT的活性和MDA含量进行检测。5、取小鼠新鲜肝脏采用甲醛溶液固定后,于HE染色观察小鼠肝脏病理学的改变;采用戊二醛溶液固定后,在透射电镜下观察小鼠肝脏超微结构的变化。6、采用免疫组织化学染色技术观察小鼠肝脏中TNF-α蛋白的表达情况。7、通过蛋白印迹法检测CSCP作用后的小鼠肝组织中Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、Cytosolic Cyt c、TNF-α、JNK、P-JNK蛋白的表达情况。研究结果1、对小鼠急性毒性实验结果表明cscp最大给药量为8.0g/kg,小鼠无异常行为,且无死亡现象发生,饲养结束后解剖观察,发现小鼠心、肝、脾等器官完整,表明cscp对小鼠是安全无毒副作用的。2、造模后小鼠血清中转氨酶ast、alt的活性显著升高,并有显著性差异,表明细胞损伤严重,ast、alt透过细胞膜被大量释放;cscp给药组小鼠血清中ast、alt的活性降低,表明cscp抑制了转氨酶的释放;肝损伤模型小鼠血清中у-gt活性升高,表明肝脏内小胆管或毛细胆管受到了严重的损伤;cscp给药组у-gt活性降低,抑制效果明显;模型组中alp的活性显著升高,表明在ccl4刺激下肝脏内的alp大量分泌至血清中,致使alp活性升高;cscp给药组alp活性与模型组相比显著降低,抑制了损伤肝细胞内alp活性的升高,表明cscp有助于肝细胞受损小鼠血清中转氨酶活性的恢复。3、对小鼠日常形态观察发现,正常组小鼠毛发光亮,精神状态较好,有主动觅食、饮食的倾向;肝损伤小鼠毛发灰暗,精神萎靡不振,有嗜睡现象,无主动觅食、饮食的倾向,不受外界环境发生变化的影响;阳性药物组和cscp给药组小鼠较模型组,精神状态逐步有所改善。对小鼠解剖后内脏形态观察发现,正常组小鼠内脏器官完整,无异物出现;肝损伤小鼠肝脏肿大,颜色深;阳性药物组和cscp各用药组的小鼠内脏完整,颜色逐渐较浅;低剂量组小鼠的肝脏颜色深于高剂量组,而高剂量组小鼠的肝脏体积小于低剂量组。对小鼠体重记录观察发现,在实验期间各组小鼠体重均有所增加,增幅较多是cscp各剂量组。与肝损伤小鼠比较,阳性药物组小鼠体重增加并不明显;在给予cscp后,小鼠体重增加明显,cscp给药组效果好于阳性药物组。4、造模后小鼠肝组织匀浆中sod活性显著降低,抗氧化能力受阻,同时脂质过氧化产物mda含量也明显升高,表明小鼠肝细胞受损严重;cscp给药组中抗氧化酶sod的活性增强,mda含量降低,表明cscp有增强肝损伤小鼠体内抗氧化酶活性的能力;肝损伤模型中gsh-px和cat的活性较低,表明gsh-px没能够发挥其特异性催化作用,没有把多余的自由基还原为水和羟自由基;cscp给药组中gsh-px和cat活性升高,说明cscp可以在一定程度上提高抗氧化酶的活性,抑制脂质过氧化产物mda含量的升高。5、he染色观察到造模后小鼠肝小叶不完整,肝索紊乱,大量炎症细胞浸润,脂肪变性,说明肝细胞损伤严重;cscp给药组小鼠肝小叶较为完整、肝索排列清晰,炎症细胞减少、脂肪变性减弱,说明cscp可以较好地修复肝组织;进一步通过透射电镜对小鼠肝脏超微结构进行观察,发现造模后小鼠肝组织内出现线粒体肿胀明显、脂肪病变、炎症细胞浸润等症状,说明肝细胞损伤严重;在给予cscp后小鼠肝组织受损情况得到改善,线粒体肿胀减弱、脂肪病变减轻、炎症细胞浸润减少,he染色和透射电镜结果一致。6、免疫组织化学染色技术结果显示肿瘤坏死因子tnf-α在模型组阳性表达明显,其在细胞凋亡中的重要作用也得到证实,表明模型组小鼠肝脏损伤情况严重;cscp给药组肝组织肿瘤坏死因子tnf-α阳性表达减弱,表明小鼠肝损害程度减轻。7、进一步采用westernblotting探究小鼠肝损伤的机制,结果发现造模后小鼠肝脏蛋白的jnk通路中jnk蛋白磷酸化增强,jnk的磷酸化可能启动了死亡受体通路,促使了细胞凋亡信号的发生,bcl-2家族促凋亡基因bax蛋白表达量升高,抑凋亡基因bcl-2蛋白表达减少,bcl-2和bax表达失衡,加速细胞的凋亡,在bcl-2家族的影响或机体自身调节下,大量细胞色素ccytosoliccytc被释放至胞浆,刺激caspase家族发挥其作用,激活caspase-9,在逐级反应下促使cleavagecaspase-3执行细胞凋亡;给予cscp后小鼠肝脏蛋白中jnk基因磷酸化减弱,bcl-2家族促凋亡基因bax蛋白表达量减弱,抑凋亡基因bcl-2蛋白表达增强,减少细胞色素ccytosoliccytc在胞浆内的释放,caspase-9蛋白表达活化减弱,cleavagecaspase-3执行细胞凋亡受阻,肿瘤坏死因子tnf-α蛋白表达减弱,从而达到对小鼠肝损伤的保护作用。研究结论通过对我们一系列实验结果的研究,我们发现cscp对小鼠急性、慢性肝损伤模型都有着较好的保护作用。1、cscp急性毒理学试验结果表明该样品对小鼠使用后,小鼠的反应是安全无毒的,这确保了在接下面小鼠体内的实验顺利进行。2、造模后,小鼠精神状态萎靡,食欲减退,出现了嗜睡现象。模型组小鼠血清中ast、alt、alp、у-gt活性显著升高,肝组织匀浆中sod、gsh-px、cat活性也明显降低,mda含量大幅升高,病理学观察发现肝脏损伤严重,造模成功。3、通过对小鼠肝脏损伤前后,cscp对小鼠的日常形态、解剖前后的观察,以及在实验期间各组小鼠体重的变化。我们可以得出结论cscp不仅有利于小鼠精神状态的恢复,在对小鼠受损内脏的恢复方面也起到帮助作用,而且cscp可以有助于小鼠体重的增加。4、cscp可以明显降低肝损伤小鼠血清中ast、alt、alp、у-gt活性,明显升高肝组织匀浆中SOD、GSH-Px、CAT活性,显著降低MDA含量。5、HE染色结果显示CSCP能够有效改善小鼠肝脏病变程度,肝小叶趋于完整,肝索排列规律,炎症细胞浸润和空泡减少,核固缩也不明显。透射电镜观察结果表明CSCP作用于肝损伤小鼠后,小鼠肝脏超微结构明显好转,核膜边界逐渐清晰,细胞器完整,线粒体数量增多,异染色质边聚减弱,粗面内质网扩张减轻。6、免疫组织化学染色技术发现CSCP可以明显减少TNF-α蛋白在肝脏内表达,减弱肝损伤程度。7、蛋白印迹法结果显示CSCP作用于肝损伤小鼠后,两组模型中JNK基因磷酸化程度减弱,肿瘤坏死因子TNF-α蛋白表达量降低,抑凋亡基因Bcl-2蛋白表达量增加,促凋亡基因Bax和Caspase家族的Cleavage Caspase-3、Caspase-9蛋白表达显著降低,细胞色素C Cytosolic Cyt蛋白表达也明显降低。