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背景：据流行病学统计腹腔粘连好发于腹部各种类型手术,带来如肠梗阻、不孕不育、盆腹腔痛、二次手术繁杂以及死亡率增高等诸多并发症及风险,给患者精神和经济上带来双重负担。目前在腹腔粘连的预防治疗方法有限,虽然各种抗粘连措施和微创技术的应用和普及,加上直到最近其病理生理尚未清楚,至今尚无一种理想手段防治术后腹腔粘连并能在各层次医疗单位外科临床普及应用。课题组前期依据多年临床治疗经验和研究成果,确立气滞血瘀为腹腔粘连的病理基础,活血通腑为基本治法。运用现代医学生物学手段在基础实验层面进行研究,前期研究表明活血通腑方优化方可以显著降低腹腔粘连大鼠外周血和腹腔液中FIB、FDP含量,下调粘连组织中TGF-β mRNA表达。活血通腑方含药血清能下调术后TGF-β1、FN、CTGF蛋白含量水平从而影响术后的纤溶机制抑制腹腔粘连的形成。活血通腑方整体与离体水平显示出对腹膜间皮细胞功能调控作用效果的一致性。项目组前期实验中,研究发现活血通腑方在术后不同时相给药效果差异明显,此现象与CD40/CD40 L触发的炎症因子引发的级联状态进程有无联系,目前尚不清楚。目的：本研究旨在建立同时测定复方活血通腑方中对羟基红花黄色素A、延胡索乙素、山柰酚、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚8个有效成分含量的HPLC-DAD测定方法。从调控腹膜间皮细胞CD40/CD40L信号通路入手,通过整体动物实验与细胞实验相互结合观察活血通腑方对术后免疫激活、炎症反应及纤溶失衡导致的粘连形成的影响,验证活血通腑方抗腹腔粘连的机制是否通过调控CD40/CD40L系统功能来促进恢复机体炎症反应与纤溶平衡,探讨活血化瘀法防治术后腹腔粘连的免疫调节机制。方法：(1)采用高效液相色谱法,色谱柱Elite Sino Chrom BP C18 (4.6mm×250 mm, 5 μm),以甲醇-1%冰醋酸溶液为流动相进行梯度洗脱；流速1.0 mL·min-1,柱温30℃,检测波长254、280、365和400 nm。(2)通过酶联吸附法(ELISA)测定IL-8、IL-10口TNF-α含量,同时实时荧光定量(RT-PCR)检测粘连组织中Col-I mRNA的表达,筛选活血通腑方的最佳有效剂量。(3)选用SD雄性大鼠150只,采用锉刀法建立术后腹腔粘连大鼠模型,随机分为模型组、活血通腑方低、中、高剂量组(2、6、18g·kg-1)、四磨汤组五组,每组大鼠30只,另取30只为假手术组。各组按规定剂量灌胃治疗2周,分别于实验第1d、3d、5d、7d、14d时,通过观察腹腔粘连评分和粘连组织病理变化以评价活血通腑方最佳剂量治疗大鼠术后腹腔粘连的疗效,同时采用检测其外周血CD40、CD40L表达,免疫组化检测粘连组织CD40、CD40L、MCP-1、MMP-9蛋白水平。(4)采用腹腔注射胰酶消化的方式建立RPMC的细胞模型,运用血清药理学方法制备不同剂量的活血通腑方含药血清,细胞培养经鉴定成功后分组(空白组、空白血清组、活血通腑方低剂量组、活血通腑方中剂量组、活血通腑方高剂量组),应用MTT法检测活血通腑方含药血清对大鼠腹膜间皮细胞的作用。(5)运用不同浓度脂多糖(LPS)于不同时间点刺激腹膜间皮细胞,分别利用ELISA检测细胞上清液中IL-Iβ、IL-6蛋白含量,qRT-PCR检测IL-Iβ、IL-6 mRNA,扫描电镜观察正常大鼠腹膜间皮细胞和LPS刺激后腹膜间皮的形态学,寻找PA体外模型最佳造模方法以及LPS的最佳刺激时间和剂量。(6)采用RT-PC R和WesternBlot观察活血通腑方含药血清对LPS刺激后大鼠腹膜间皮细胞C D40、CD40L、MCP-1、MMP-9 mRNA和蛋白表达的影响。结果：(1)8个成分的方法学考察均符合要求,阴性无干扰。(2)活血通腑方中剂量组降低血清IL-8和TNF-α水平,但是升高IL-10水平,同时降低粘连组织中Col-Ⅰ mRNA的表达,有显著性统计学意义(P<0.05或P<0.01)。(3)与模型组比较,活血通腑方中、高剂量组肉眼腹腔粘连评分和镜下评分在术后第3天和第7天明显低于模型组,均有显著性差异(P<0.01)。各组在不同时间点能不同程度降低外周血中CD40和CD40L的水平；同时降低粘连组织中CD40、CD40L和MCP-1蛋白表达水平(P<0.05)。(4)与空白血清组比较,活血通腑方中剂量组含药血清可显著促进RPMC细胞增殖,作用时间以36 h时最为显著。(5)ELISA测得各组大鼠腹膜间皮细胞培养上清液IL-1p和IL-6浓度随着时间的推移和浓度的增加,而表现出明显的差异性(P<0.01),尤其以24小时10μg/ml为LPS最佳刺激时间和最佳刺激浓度。RT-PCR实验中LPS最佳刺激时间为24 h,但是最佳刺激浓度为5 μg/ml。正常腹膜间皮细胞扫描电镜下表面被丰富的微绒毛所覆盖。LPS刺激后腹膜间皮细胞剥脱、肿胀明显,具有细胞间隙,偶见基底膜。(6)活血通腑方含药血清对LPS刺激RPMCs呈剂量依赖性降低CD40、CD40L、MCP-1、MMP-9蛋白和mRNA表达。结论：(1)TLC联合HPLC法可用于复方活血通腑方的质量控制,为后续药效学研究的进一步深入提供科学依据和标准。(2)活血通腑方中剂量组可通过调节IL-8、IL-10和TNF-α的水平抑制炎症反应,同时减少细胞外基质Col-Ⅰ mRNA的沉积,有效减轻腹腔粘连的程度。(3) CD40、CD40L、MCP-1参与术后腹腔粘连形成,活血通腑方改善腹腔粘连程度的药理机制可能是有效抑制CD40/CD40L活化作用,降低MCP-1的表达,减少机体免疫及炎症反应。(4)活血通腑方含药血清具有诱导大鼠腹膜间皮细胞增殖的作用。(5)脂多糖刺激大鼠腹膜间皮细胞可诱发炎症损伤,进一步放大炎症反应。(6)活血通腑方含药血清可通过降低CD40、CD40L表达,减轻MCP-1水平,缓解炎症反应,下调MMP-9表达,减轻胶原沉积,可能为抗腹腔粘连的有效措施。