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目的 利用原核表达系统制备具有良好抗原特性的麻疹病毒(Meales virus,MV)重组核蛋白,以此作为包被抗原,初步建立检测MV抗体的间接酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法,并将其应用于人群抗体水平的评估。方法 选取 NCBI(National Center for Biotechnology Information,NCBI)和国家麻疹实验室提供的MV核蛋白的基因序列,将其羧基末端450个核苷酸翻译后进行氨基酸序列一致性分析,选取目的序列。提取MVRNA,反转录后进行PCR扩增,得到核蛋白基因全长序列,并利用相关生物学软件对其进行密码子优化,将目的基因连接至pET-32a(+)表达载体,构建重组表达质粒pET-32a(+)-MV-N,序列鉴定正确后转化至表达菌BL21(DE3),利用异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-Thiogalactoside,IPTG)诱导表达,用特异性抗体进行Western Blot鉴定。盐析法粗纯后经镍柱亲和层析纯化目的蛋白,获得高纯度的重组核蛋白,并对其进行电镜观察。以重组核蛋白作为包被抗原建立间接ELISA检测方法,对各工作条件进行筛选和优化,确定间接ELISA法的操作流程,并检测157份健康儿童和新生儿母亲血清中的抗MVIgG抗体,与商品化MV ELISAIgG抗体检测试剂盒进行比较。结果 根据序列一致性分析结果,将氨基酸序列同源性为100%的归为一组,占总序列条数比重最大的一组中有142条序列,该组序列时间跨度长,来源地区广,从中选取一株作为本研究模板,利用原核表达系统进行表达,获得MV重组核蛋白为76KD,可被特异性多克隆抗体识别。经过纯化后,蛋白纯度可达90%以上,可形成典型的鲱鱼骨样核衣壳结构。使用该蛋白建立的间接ELISA方法批内和批间的重复性试验变异系数均小于10%,与试剂盒检测结果相比,血清标本的总符合率为95.5%,灵敏度和特异度分别可达94.8%和98.3%。其中,两种方法检测的85份0～15岁健康儿童血清MVIgG抗体阳性率,无论是<8月龄组或8月龄～15岁组,结果差异均无统计学意义(χ2=0.313,P>0.05;χ2=0.000,P>0.05),且通过本研究所建立的ELISA方法检测的MV抗体水平表现出与试剂盒检测结果在不同年龄组一致的增减趋势,两种方法定量结果的相关系数r为0.893(P<0.001),显示出该方法具备的定量潜力。结论 利用原核表达系统成功制备出具有良好抗原特性的重组核蛋白,利用该重组抗原建立的ELISA方法具有良好的稳定性,且灵敏度高、特异度强,与商品化试剂盒检测结果无明显差异,可用于麻疹病毒血清流行病学调查和疫苗免疫后人群抗体水平的评估。图[13]表[11]参[41]