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目的:雌激素是非靶器官肿瘤肺癌特别是非小细胞肺癌(Non-Small Cell Cancer,NSCLC)的重要促癌因素,本研究探讨在NSCLC中起主导作用的雌激素受体ER(EstrogenReceptor)β 1、2、5 的具体表达和功能。方法:采集自2008年10月-2014年2月在华中科技大学同济医学院附属同济医院胸外科手术切除患者且术后病检诊断为NSCLC的肿瘤组织113例,抽取对应患者包括性别、年龄、吸烟指数、组织类型、分化程度、TNM分期在内的临床病理资料,电话、电子邮件、或信件随访获得术后总生存时间(Overall Survival,OS),采用免疫组织化学检测ERβ1、2、5、Ki67、胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)表达,比较ERβ1、2、5表达与临床病理特征、Ki67、IGF1R表达的相关性,绘制KaplanMeier曲线比较ERβ 1、2、5表达与OS的关系,采用Cox模型对ERβ 1、2、5表达与OS关系进行单因素、多因素分析。结果:在人NSCLC组织标本中,细胞浆/细胞核(c/n)ERβ 1、2、5均存在不同程度的高表达,cERβ1、5高表达的癌组织增殖指标分子Ki67表达水平更高;cERβ5在≥55岁的老龄患者中表达更高,cERβ1强阳性表达(+++)在Ⅳ期患者中比例更高,cERβ 1 与 cERβ 5、IGF1R、Ki67 表达正相关,cER β 5 与 IGF1R、Ki67表达正相关;cERβ1、cERβ 5强阳性表达的NSCLC患者术后OS更短,Cox风险模型提示cERβ 1、cERβ 5表达是NSCLC患者术后更差OS的独立预测因素。结论:本部分研究提示ERβ亚型1、5在肺癌的发生和发展中可能起重要作用,雌激素通路与IGF1通路在NSCLC中表达存在相关性,ERβ 1、2、5业型在NSCLC进展发挥的功能可能并不相同,可能是雌激素促进NSCLC进展重要的功能分子,有可能作为新的预后判断因子和潜在的治疗靶点。目的:ERβ1、2、5对NSCLC增殖、转移能力作用还不清楚,而这些生物学效应是否与IGF1通路有关也未见相关报道,本部分旨在探讨ERβ 1、2、5在NSCLC进展中的功能及可能机制。方法:选取 A549 和 H1793 两株 NSCLC 细胞,构建 siRNA-ERβ1、siRNA-ERβ2、siRNA-ER β 5 瞬时敲降模型,构建 pcDNA3.1-ERβ 1、pcDNA3.1-ERβ 2、pcDNA3.1-ERβ 5过表达模型,构建shRNA-ERβ 1、shRNA-ERβ 2、shRNA-ERβ 5慢病毒稳定敲降模型。采用免疫荧光法检测加入E2后A549和H1793细胞中ERβ 1、2、5、IGF1R蛋白表达、定位情况。采用CCK8、Edu、Transwell法检测A549和H1793细胞转染siRNA-ERβ1、siRNA-ERβ2、siRNA-ER β 5 或 pcDNA3.1-ER β 1、pcDNA3.1-ER β 2、pcDNA3.1-ERβ5后增殖、侵袭、迁移能力的变化。采用CCK8、划痕实验检测A549和 H1793 细胞转染 pcDNA3.1-ERβ1、pcDNA3.1-ER β 2、pcDNA3.1-ERβ 5 后再敲降IGF1R对增殖、迁移能力的影响。构建慢病毒shRNA-NC、shRNA-ERβ1、shRNA-ERβ 2、shRNA-ER β 5感染A549细胞,分组于NODSCID小鼠右侧腋下种植皮下移植瘤,定期记录肿瘤大小,29天后剥取皮下瘤,比较各组肿瘤体积、重量,肿瘤组织行IGF1R肿瘤组织染色,比较稳定敲降ER β 1、2、5对对小鼠皮下瘤生长的影响。结果:ER β 1、2、5为绿色荧光,在细胞核、浆中均有定位,ERβ2、5细胞浆染色更明显,加入E2后染色程度明显加深;IGF1R为红色荧光,以细胞浆染色为主,IGF1R与相应的ERβ1、2、5染色定位和强度具有一致性,而且,ERβ 1、2、5组加入E2后IGF1R表达均较对照组增强。A549细胞、H1793细胞中siRNA-ERβ 1(P<0.01)和siRNA-ERβ 5组(P<0.01)较siRNA-NC中细胞数量和增殖细胞比例明显降低、siRNA-ER β 2 组较 siRNA-NC 组无明显变化。siRNA 敲降 ER β 1、5 后,A549 和 H1793细胞穿过铺/不铺Matriel胶的小室细胞数量较对照组明显下降(P均<0.01)。A549、H1793 细胞中 pcDNA3.1-ERβ 1(P<0.01)和 pcDNA3.1-ERβ 5 组(P<0.01)较对照组细胞数量和增殖细胞比例明显升高,pcDNA3.1-ERβ2组与pcDNA3.1组相比无明显变化。采用pcDNA过表达ERβ 1、5后,A549和H1793细胞穿过铺/不铺Matriel胶的小室细胞数量较对照组明显增多(P均<0.01)。而pcDNA3.1-ERβ1+siRNA-IGF1R、pcDNA3.1-ER β 5+siRNA-IGF1R 组较 pcDNA3.1-ER β 1、pcDNA3.1-ERβ5组迁移能力显著降低。小鼠皮下瘤模型中,shRNA-ERβ1、shRNA-ERβ5较shRNA-NC组肿瘤大小明显减小,shRNA-ERβ2与对照组无明显差异,shRNA-ERβ1(P<0.01)、shRNA-ERβ5(P<0.01)较 shRNA-NC 肿瘤重量明显减轻,敲降ERβ 1、2、5后,IGF1R+++、++染色组比例均有不同程度降低,+组比例明显升高。结论:本部分研究提示ERβ1、5在雌激素激活后上调IGF1通路促进NSCLC细胞增殖、增强转移能力,而这些作用可能与IGF1R激活通路有关,下一步研究的重点即探索ER β 1、5激活IGF1通路的具体机制。目的:ERβ 1、5在E2激活后可能进一步上调IGF1通路促进NSCLC进展,这一效应更深层的作用机制尚不清楚。探讨ERβ亚型尤其是ERβ1、5与IGF信号通路的调控机制是阐明雌激素促肺癌进展的重要思路和方向。方法:构建 siRNA-NC、siRNA-ERβ1、siRNA-ERβ2、siRNA-ERβ5 分别转染 A549和H1793细胞,按处理组别加入或不加E2,提取总mRNA,逆转录成cDNA后采用realtime-PCR检测ERβ 1、2、IGF1的mRNA变化。选择人IGF1启动子区2kb的序列,软件预测得出6个与ERE(Estrogen Response Element)区同源相似的EREL(ERE-Like)区,将E2处理的A549细胞裂解液上清作Input为阳性对照组,ERβ1、2、5为分别使用ERβ 1、2、5抗体进行免疫沉淀后结果,为实验组,IgG为使用对照抗体进行免疫沉淀后结果,为阴性对照组,检测ERβ 1、2、5分别与A549细胞IGF1启动子区相应的EREL区直接结合。采用Dual-Luciferase双荧光素酶报告基因检测系统进行荧光素酶活性测定,在E2处理的A549细胞中检测ERβ 1、2、5与IGF1启动子区相应的EREL区直接结合后,是否具有功能、激活IGF1转录活性。结果:A549和H1793细胞转染siRNA-ERβ1后IGF1 mRNA水平较对照组下降,这一效应在加入E2后更明显,A549和H1793细胞转染siRNA-ERβ 2后IGF1 mRNA水平较对照组下降,这一效应在加入E2后更明显,A549和H1793细胞转染siRNA-ERβ 5后IGF1 mRNA水平较对照组下降,这一效应在加入E2后更明显。人IGF1启动子区2kb的序列找出6个EREL区,命名为Site1-6,碱基序列分别是:Site1:ATGACATCATAACCC,Site2:AGGGGACAGTGACAG,Site3:ATGAGACAGTGCCCT,Site4:GTGTCTTCATGCCCA,Site5:TTGTCACCATGCCCA,Site6:TAACTTTGCCAG。E2处理后的A549细胞采用ChIP实验发现:IGF1基因启动子的Non-ERE区未见ERβ 1、2、5蛋白与之结合,ERβ 1与Site2、5、6位点特异结合,ERβ 2与Site1、3、4、5、6位点特异结合,ERβ5与Site2、3、4位点特异结合。双荧光素酶报告基因检测发现:ERβ 1、2、5与IGF1启动子区相应的EREL区直接结合后,能激活IGF1转录活性,其活性EREL区分别对应为:ERβ1(Site2、5、6),ERβ2(Site1、3),ERβ5(Site2、3、4)。结论:E2 激活 ERβ 1、2、5 上调 A549 和 H1793 细胞 IGF1mRNA 表达,ERβ1、2、5分别与A549细胞IGF1启动子区相应的EREL区直接结合、并激活IGF1启动子转录活性,ER1、2、5通过基因途径调控IGF1转录的结合位点并不相同。ERβ 1、5在促进NSCLC进展上具有独特的功能和机制,以此提出基于雌激素角度的新的NSCLC分子分型,是进一步了解NSCLC生物学特征的重要一步,也有望据此提出新的诊断分类、预后预测指标,有针对性地制定肺癌的内分泌治疗靶标,有待进一步探索。