【摘 要】
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三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer,TNBC）由于预后较差,迫切需要新手段来提高其疗效。嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor,CAR）T细胞疗法已在血液瘤中取得了较好的临床效果,并已逐步延展到实体瘤的临床前研究。由于CAR-T细胞的作用方式目前尚不清楚,示踪技术的应用可以更好的了解细胞间的生物学特性,同时对于优化CAR-T细胞免疫治
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三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer,TNBC）由于预后较差,迫切需要新手段来提高其疗效。嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor,CAR）T细胞疗法已在血液瘤中取得了较好的临床效果,并已逐步延展到实体瘤的临床前研究。由于CAR-T细胞的作用方式目前尚不清楚,示踪技术的应用可以更好的了解细胞间的生物学特性,同时对于优化CAR-T细胞免疫治疗具有重要的作用。表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor,EGFR）在45-70%的TNBC中高表达,预示了其作为TNBC靶标的可行性。因此,本研究通过慢病毒转染的方法构建携带RFP的第三代EGFR-CAR Jurkat细胞和携带EGFP的EGFR阳性乳腺癌细胞,并进行克隆筛选纯化;CCK-8法检测四种Jurkat细胞的增殖情况;Real-Time PCR和western-blot分析EGFR-CAR-RFP基因的表达;ELISA检测培养上清中IL-2的分泌情况。首先,通过克隆第三代CAR基因结构,成功构建了三个携带RFP的EGFR的特异性CARs以及三种重组CAR-T慢病毒。接着,通过克隆挑选纯化成功获得了稳转EGFR-CAR-RFP基因的T细胞系和稳转EGFP的EGFR阳性乳腺癌细胞系。最后,Real-Time PCR结果表明,与未转导Jurkat细胞相比,转导EGFR-CAR-RFP基因的三种Jurkat细胞其外源CD3ζ的m RNA水平均极显著性的升高（P<0.001）。Western-blot结果也表明三种转导EGFR-CAR-RFP基因的Jurkat细胞的外源CD3ζ的蛋白水平都比未转导的Jurkat细胞高。CCK-8实验结果表明转导EGFR-CAR-RFP基因的Jurkat细胞与未转导的Jurkat细胞的增殖情况无统计学显著性差异（P>0.05）。ELISA结果表明在效靶比为1:1的共培养组中,与Con-CAR-RFP Jurkat细胞共培养组相比,两组与EGFR-CAR-RFP Jurkat细胞共培养组中IL-2的分泌量均极显著性的升高（P<0.001）;随着共培养比例的增大,与Con-CAR-RFP Jurkat细胞共培养组相比,与EGFR-CAR1-RFP和EGFR-CAR2-RFP Jurkat细胞共培养组中IL-2的分泌量均极显著性的升高（P<0.01,P<0.001）。综上所述,本研究成功构建了三种靶向EGFR的CAR-Jurkat细胞,并验证了其对EGFR阳性乳腺癌的特异性识别作用,为EGFR-CAR修饰PBMC来源的T淋巴细胞应用于TNBC细胞免疫治疗的研究提供了实验参考。
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