论文部分内容阅读
研究背景及目的:乳腺癌(Breast Cancer)是女性最常见的恶性肿瘤。肿瘤发生转移常导致乳腺癌治疗困难,并且是导致患者死亡的主要原因。上皮间质转化(Epithelial Mesenchymal Transition,EMT)在肿瘤细胞发生发展、转移的过程中起着至关重要的作用,绝大多数乳腺癌为上皮来源。大量研究通过生物学实验、高通量测序等方法,已在各类肿瘤中鉴定出大量与肿瘤相关的circRNAs。同样的,在乳腺癌中也发现了大量表达差异的circRNA。然而,乳腺癌EMT过程中circRNA的整体改变却鲜为人知。本研究拟分析circRNA在乳腺癌细胞EMT过程中的变化,利用高通量测序技术分析MCF-7、MDA-MB-231细胞EMT模型组和空白组中差异表达的circRNA表达谱。探讨其在乳腺癌EMT过程中发挥的作用。方法:1、构建并鉴定乳腺癌上皮间质转化模型。观察其细胞形态改变。使用RT-qPCR、Western blot方法检测其E-cadherin、Vimentin的表达。2、利用高通量测序技术分析MCF-7、MDA-MB-231细胞EMT模型组和空白组中差异表达的circRNA表达谱。用GO和KEGG分析差异表达的circRNA。3、从中共筛选出5个circRNAs,其标准如下:1)在MCF-7和MDA-MB-231细胞的EMT模型组中分别与空白对照组相比发现上调或下调;2)较高的倍数变化;3)较丰富的表达水平。利用RT-qPCR和Sanger测序验证。随后预测五个候选circRNA的靶基,从而绘制circRNA?miRNA?mRNA网络。4、选择差异最大的circSCYL2进行研究。在南昌大学第二附属医院(2018年1月至2019年7月)接受手术切除的患者中,获得20对乳腺癌组织和正常邻近组织(距肿瘤组织边缘>2cm)。采集的标准为:1)经验丰富的3位临床病理医师诊断为乳腺癌;2)术前无放疗或化疗;3)临床及病理资料完整。排除标准:1)临床医师诊断为合并其他不同类型的肿瘤或同时具有严重身心疾病患者;2)临床及病理资料不全。用RT-qPCR检测其circSCYL2的表达。随后构建circSCYL2过表达载体进行细胞转染。利用RT-qPCR方法验证转染后的乳腺癌细胞circSCYL2的表达,RT-qPCR、Western Blot方法检测其E-cadherin和Vimentin的表达情况。通过Transwell实验检测处理组(pcDNA circSCYL2)和对照组(pcDNA circ)细胞的迁移和侵袭能力。结果:1、经诱导48h后,发现MCF-7和MDA-MB-231细胞都出现间充质细胞的特征。镜下观察乳腺癌细胞随着伪足的延伸,细胞逐渐变长,呈细长圆形或多边形,并变成纺锤形。乳腺癌细胞间的空间变宽变大,细胞散开,分布不规则。两种细胞E-cadherin的表达程度都明显下降,而Vimentin表达明显升高。2、高通量测序技术检测测序在junction reads中共检测到23347个circRNA,其中MCF-7细胞空白对照组和EMT模型组分别检测到10715和10412个circRNA,MDA-MB-231细胞分别检测到5035和5405个circRNA。在MCF-7细胞的空白对照组和EMT模型组中分别检测到7057和6754个circRNAs单独表达,两组共同的circRNAs检测到3658个。在MDA-MB-231细胞的空白对照组和EMT模型组中分别检测到3717和4087个circRNAs单独表达,发现两组共同的circRNAs有1318个。MCF-7细胞EMT模型组与空白对照组比较共有1402个circRNAs表达显著差异,其中773个表达明显上调,629个下调。MDA-MB-231细胞EMT模型组与空白对照组比较共有322个circRNAs表达显著差异,其中163个circRNAs表达上调,159个circRNAs表达下调。在所有这些与相应的空白对照组相比表达差异的circRNAs中,我们分析发现在MCF-7-EMT和MDA-MB-231-EMT组中共同表达明显上调的circRNA有7个,下调的circRNA有16个。根据GO分析,我们发现MCF-7和MDA-MB-231细胞中最丰富的功能项与免疫/炎症反应和细胞粘附/粘附连接有关。MCF-7细胞KEGG分析揭示了差异表达的circRNA与多种参与肿瘤生长调控的信号通路有关。MDA-MB-231细胞KEGG分析结果表明差异表达的circRNA与肿瘤细胞的迁移有关信号通路相关。3、对筛选出来的五个circRNA(circ-MYO9A、circ-DNAJC3、circ-ANKRD12、circ-DEK、circSCYL2)构建了circRNA-miRNA-mRNA网络。我们发现这5个circRNA的一些靶基因,如OSR1、DRD2、MAP3K8和TNFSF4等。circ-MYO9A、circ-DNAJC3、circ-ANKRD12、circ-DEK和circSCYL2在EMT模型组中RT-qPCR检测结果都是下调的。其RNA-seq结果与RT-qPCR信息进行比较时,我们发现在EMT模型组中五个circRNA中只有三个被下调。circ-ANKRD12、circ-DEK和circSCYL2的RT-qPCR结果与测序结果一致。而circ-MYO9A和circ-DNAJC3的结果相反。其中值得注意的是circSCYL2差异最明显。对circSCYL2 PCR产物进行验证,结果发现circSCYL2仅由cDNA中的发散性引物扩增,gDNA中未观察到扩增产物。circSCYL2是来自SCYL2基因的第2至4外显子,长度为508 nt,通过Sanger测序证实了circSCYL2 RT-PCR产物的反向剪接连接具有预期的大小。4、我们发现乳腺癌组织中circSCYL2的表达明显下降。通过RT-qPCR检测结果证实了转染后的MCF-7和MDA-MB-231细胞circSCYL2的表达明显增加。同时,E-cadherin在转染后MCF-7和MDA-MB-231细胞中的表达显著增加,而Vimentin的表达显著降低。circSCYL2过表达抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭。结论:我们构建了乳腺癌EMT模型。利用全转录组测序在乳腺癌EMT模型组和空白对照组之间筛选了差异表达的circRNA,我们分析发现在MCF-7-EMT和MDA-MB-231-EMT组中共同表达明显上调的circRNA有7个,下调的circRNA有16个。并且通过生物信息学分析发现这些circRNA与免疫/炎症反应以及细胞增殖/细胞粘附功能相关。我们研究发现circSCYL2及其靶基因OSR1在乳腺癌细胞中被下调。而circSCYL2在乳腺癌细胞中的过表达抑制了乳腺癌细胞转移能力。OSR1与肿瘤的进展呈负相关。我们的研究表明在乳腺癌细胞的EMT模型中,circSCYL2及其靶向TGF-β信号通路的靶基因OSR1被显著下调,证明circSCYL2可能是通过OSR1/TGF-β轴调控乳腺癌EMT。所有这些表明,与EMT进展有关的circSCYL2可能成为乳腺癌潜在的生物标志物。